木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途技术

本发明专利技术公开了一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途；本发明专利技术以深绿木霉SG3403和枯草芽孢杆菌22菌株作为共培养对象，以共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率为响应值，通过响应面方法对培养温度，转速，pH，玉米粉含量，糖蜜含量，酵母粉含量和KCl含量等发酵条件进行优化，得到最佳的发酵条件为：28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L。本发明专利技术配方培养的共培养发酵液提高了对小麦赤霉病菌的抗性，并在共培养发酵液中发现了单一培养没有的物质，用其制备的种衣剂促进了小麦的生长，为生物农药和生物种衣剂的开发提供了新的选择。

Co culture method of Trichoderma and Bacillus and application of their co metabolites

【技术实现步骤摘要】
木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途
本专利技术涉及一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途；具体涉及一种针对防治小麦赤霉病、促进小麦生长的木霉菌和芽孢杆菌共培养技术的优化方法及其代谢产物对小麦赤霉病菌的拮抗作用和对小麦幼苗长的促生方面的应用。
技术介绍
木霉菌和芽孢杆菌是一种重要的农业和工业微生物，特别是用作生防菌剂和植物生长促进剂。然而两种微生物单一使用均有一定的局限性。木霉菌主要通过竞争、重寄生和诱导抗性作用防治土传病害，而芽孢杆菌主要通过抗生作用防治叶部病害。从次生代谢谱上，两者也明显不同。木霉菌可产生100多种结构多样的次生代谢物，主要有聚酮类(Polyketides)、烷基吡喃酮类(Ajkylpyrones)、氨基酸衍生物、异腈类(Isonitries)、倍半萜烯类(Sesquiterpens)、类固醇类(Steroids)和抗菌肽类(Petaibols)等,多数是通过非核糖体肽合成酶(NRPs)、聚酮合酶(PKSs)以及氧化还原酶，酰基转移酶和糖基转移酶等代谢产物修饰酶负责代谢产物合成。例如：木霉菌素(trichodermin)、6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-Pentyl-2H-pyran-2-one)、胶霉素(gliotoxin)和绿胶霉素(viridin)等。芽孢杆菌则产生多种抗菌物质，如核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素(subtilin)等,非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、丰原素(fengycin)等。此外，这两种微生物都可以产生植物生长调节剂，包括IAA、IBA、GA等。因此如能将两类生防微生物有机结合，便能实现功能互补，拓展其生物防治靶标谱。然而目前国内外实现两类微生物组合的方式主要是将两种微生物分别发酵、制备菌剂，然后按比例组合或混合使用，尽管可提高防效及稳定性，但很难创制出新型微生物农药。在正常的实验室培养条件下，微生物某些代谢产物相关生物合成基因簇处于沉默状态，通过若干微生物共培养模式，可能会激活这些沉默的生物合成基因簇的表达，从而合成在单一培养中未观察到的新的代谢产物。因此，微生物共培养可以作为提高代谢产物产量和多样性的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法，优化培养基配方以及应用效果；该木霉菌芽孢杆菌共培养发酵液可以抑制小麦赤霉病菌等多种病原真菌的生长以及促进小麦生长。本专利技术通过芽孢杆菌与木霉菌的共培养技术构建与优化，提高代谢产物的多样性和含量，提高了对小麦赤霉病菌的拮抗作用、防病效果和对小麦生长的促进作用，同时为创制新型微生物农药奠定技术基础；为生物农药和生物种衣剂的开发提供技术支撑。本专利技术所采用的生防菌为深绿木霉菌(Trichodermaatroviride)SG3403和枯草芽孢杆菌22(Bacillussubtilis22)，经纯化后转移至平板内作母菌剂，芽孢杆菌在三角瓶内振荡培养为液体菌种，木霉菌用无菌水制成孢子悬浮液。再将两种菌液接入发酵培养基共培养，以拮抗赤霉病菌(Fusariumgraminearum)等的效价为响应值，利用响应面技术对共培养条件进行优化。利用优化的配方进行共培养，用其产物做抑菌谱试验发现，优化后配方的共培养产物对多种病原真菌具有明显的抑制作用；用其产物制备的生物种衣剂能明显提高对小麦赤霉病的防效，并对小麦生长具有促进作用。具体而言，本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：第一方面，本专利技术涉及一种木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，所述方法包括如下步骤：S1、将深绿木霉TrichodermaatrovirideSG3403接种于PDA培养基平皿中，25～28℃倒置培养2～3天；用无菌水将平皿上的木霉菌孢子刮下，制成浓度为1～2x108孢子/毫升的木霉分生孢子悬浮液；S2、将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis22接种于LB培养基平皿中，30～36℃倒置培养1～2天，得LB平板菌种；在LB液体培养基中接入所述LB平板菌种，28～30℃、180转/分、培养1～2天；将所得培养液的芽孢浓度稀释至3～4x108cfu/毫升，得枯草芽孢杆菌菌液；S3、将所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液加入到共培养发酵培养基中，28～30℃，180～215转/分，培养3～5天，获得共培养发酵液。作为本专利技术的一个实施方案，所述共培养发酵培养基含：10～20克/升玉米粉，10～20克/升酵母粉，10～28克/升糖蜜。在本专利技术的一个实施例中，称取20克玉米粉，20克酵母粉，20克糖蜜，蒸馏水定容至1升，分装在50毫升三角瓶中30毫升，在121℃下灭菌30分钟制备共培养发酵初始培养基。作为本专利技术的一个实施方案，所述PDA培养基为：称取200克土豆切成1cm2的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液，加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备而得。作为本专利技术的一个实施方案，所述LB培养基为：称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备而得。作为本专利技术的一个实施方案，所述LB液体培养基含：10克/升蛋白胨，8克/升酵母粉，10克/升NaCl。在本专利技术的一个实施例中，称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，蒸馏水定容至1升，分装在50毫升三角瓶中30毫升，在121℃下灭菌30分钟制备LB液体培养基。作为本专利技术的一个实施方案，所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液、共培养发酵培养基的体积用量比为1:1:30，在此比例下，共培养发酵液的抑菌效果最佳。作为本专利技术的一个实施方案，所述步骤S3还包括：以共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率作为响应值，基于响应面法优化共培养发酵条件的步骤。所述共培养发酵液对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的抑制率是指：将共培养发酵液的无菌滤液(即，共培养代谢产物)，以200微升/10毫升培养基的量加入到PDA培养基中，通过菌丝的生长速率来判断共培养发酵代谢产物的拮抗赤霉病菌活性。所述共培养发酵液的无菌滤液是通过将共培养发酵液用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌而得。所述共培养发酵条件包括温度、转速、初始pH值、玉米粉含量、糖蜜含量、酵母粉含量和KCl含量。通过优化温度、转速、pH、玉米粉含量、糖蜜含量、酵母粉含量和KCl含量等发酵参数，提高共培养代谢产物的拮抗赤霉病菌活性真菌效价。优化后的共培养发酵条件为：共培养发酵培养基中含酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L；共培养发酵的温度为28℃，转速为214转/分，pH6.8。第二方面，本专利技术涉及一种前述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法获得的共培养代谢产物。所述共培养代谢产物为所述共培养发酵液的无菌滤液。更优选是采用优化共培养发酵条件共培养发酵而得的共培养发酵液的无菌滤液。对共培养代谢产物进行分析鉴定，该共培养代谢产物形成了单一培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/nS1、将深绿木霉Trichoderma atroviride SG3403接种于PDA培养基平皿中，25～28℃倒置培养2～3天；用无菌水将平皿上的木霉菌孢子刮下，制成浓度为1～2×10

【技术特征摘要】
1.一种木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将深绿木霉TrichodermaatrovirideSG3403接种于PDA培养基平皿中，25～28℃倒置培养2～3天；用无菌水将平皿上的木霉菌孢子刮下，制成浓度为1～2×108孢子/毫升的木霉分生孢子悬浮液；
S2、将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis22接种于LB培养基平皿中，30～36℃倒置培养1～2天，得LB平板菌种；在LB液体培养基中接入所述LB平板菌种，28～30℃、180转/分、培养1～2天；将所得培养液的芽孢浓度稀释至3～4×108cfu/毫升，得枯草芽孢杆菌菌液；
S3、将所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液加入到共培养发酵培养基中，28～30℃，180～215转/分，培养3～5天，获得共培养发酵液。


2.根据权利要求1所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述共培养发酵培养基含：10～20克/升玉米粉，10～20克/升酵母粉，10～28克/升糖蜜。


3.根据权利要求1所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液、共培养发酵培养基的体积用量比为1:1:3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婷婷，陈捷，唐家全，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31