大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法技术

本发明专利技术公开了大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法，通过扩增获得大眼鳜分泌型免疫球蛋白sIgM重链基因全长cDNA序列，全长1952bp，起始密码子ATG的上游有49bp非编码区，终止密码子ATT下游有包含Poly A在内的151bp非编码区序列，开放阅读框长1752bp；还包括583个氨基酸，氨基酸包括一个可变区V，四个恒定区Cμ1‑Cμ4；并且应用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达情况，得到sIgM在大眼鳜各组织中均有表达，各组织间的表达水平不同，头肾和脾脏中的sIgM基因表达量明显高于其他组织；为大眼鳜特异性免疫系统以及抗感染机制的深入研究奠定了基础。

Amplification of the full length cDNA sequence of sIgM gene of Siniperca chuatsi

【技术实现步骤摘要】
大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法。
技术介绍
免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，具有分泌型和膜结合型两种存在形式，分泌型免疫球蛋白存在于体液中，具有抗体的各种功能；膜结合型免疫球蛋白是B细胞膜表面的抗原受体，与中和抗原有关。鱼类是最早具有免疫球蛋白的脊椎动物，适应性免疫对鱼类防御病原菌感染具有重要的作用；IgM是最早被报道的免疫球蛋白，在特异性免疫系统的第一道防线中起着了一个至关重要的作用，IgM主要由脾脏及淋巴结中的B细胞产生，广泛分布于血液中，分子质量较大，因此又被命名为巨球蛋白，IgM单体大部分都是通过非共价键结合成四聚体，但也有其它的多聚体形式，这可能是硬骨鱼产生抗体多样性的一种机制，在硬骨鱼类中，IgM是主要的免疫球蛋白分子，由重链与轻链通过二硫键的共价链接，形成四聚体；IgM有膜结合型和分泌型两种存在形式，膜结合型与分泌型的IgM的相对分子质量不同，是由于mRNA的拼接方式不同而导致的，sIgM由B细胞分泌,作为免疫效应分子存在于血液和其他体液中；mIgM分子则作为抗原受体嵌入B细胞膜而存在，和辅助分子结合成B细胞受体复合物；IgM的纯化、序列多样性分析、系统进化树的构建在许多不同的鱼类中都有报道，如大西洋鲑、斑马鱼、大西洋鳕，IgM在体液免疫尤其是抵抗细菌性抗原侵扰方面起着重要作用，在不同的鱼类，不同的免疫组织中，IgM的表达方式不同，王欣欣等研究发现草鱼的IgM主要表达于头肾、中肾和脾脏中，阐明了这三个免疫器官是IgM表达的主要场所，此实验首次运用了荧光定量PCR的方法研究鱼类IgM基因在不同组织中的表达，IgM不仅参与系统免疫对抗病原菌感染,同时也参与黏膜中的免疫应答，对团头鲂进行腹腔注射感染嗜水气单胞菌，团头鲂肾脏，脾脏和肝sIgM基因mRNA的表达量在感染后的第7d达到峰值，在肠黏膜组织中第14d达到峰值，然而，在嗜水气单胞菌感染过程中，肠黏膜中免疫球蛋白IgM基因在蛋白水平的表达变化规律及其B淋巴细胞(IgM+B淋巴细胞)的分布、定位以及增殖特点还有待进一步的研究；在长期的鱼类病害防治过程中，人们逐步认识到通过鱼类的适应性免疫系统进行病害免疫防治的重要性；由于免疫球蛋白IgM是鱼类适应性免疫中体液免疫应答最主要的介质，因此，有关鱼类免疫球蛋白IgM的研究对鱼类病害的免疫防治显得尤为重要。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法，利用RACE-PCR和RT-PCR方法扩增获得大眼鳜分泌型免疫球蛋白sIgM重链基因全长cDNA序列，并且应用实时荧光定量PCR分析了该基因在不同组织中的表达情况，为大眼鳜特异性免疫系统以及抗感染机制的深入研究奠定了基础。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法，包括以下步骤：步骤一：总RNA提取和第一链cDNA的合成：S1.根据动物组织总RNA试剂盒说明书提取大眼鳜总RNA，选用经电泳和紫外分析检测条带清晰、完整性好的RNA用于反转录；S2.以总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，所得cDNA于-20℃保存备用；步骤二：IgM基因恒定区部分序列的扩增：S1.设计引物，根据NCBI中已知硬骨鱼类免疫球蛋白IgM基因保守区的cDNA序列设计引物IgM-F，IgM-R；S2.以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将所得目的条带回收，利用；S3.将经PCR扩增后的cDNA序列与PMD-19T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，经菌落PCR鉴定后，测序；步骤三：IgM全长cDNA的扩增：S1.新提取完整性好的大眼鳜头肾RNA，利用SMARTerRACE5'/3'Kit试剂盒反转录获得RACE模板；S2.根据已获得的中间片段设计5＇和3＇RACE引物，与UPM扩增大眼鳜IgMcDNA的5＇和3＇端；S3.将扩增后的产物经PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒纯化后与pRACE载体连接，转化到大肠杆菌DH5α株，菌落PCR检测阳性后测序；S4.将已获得的RNA片段、cDNA片段用DNAstar软件进行拼接并进行序列分析与比对，获得大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列，设计sIgM基因ORF引物对sIgM基因序列进一步的进行验证；步骤四：序列分析：S1.使用在线软件openreadingframefinder预测氨基酸序列并寻找ORF；S2.用Blasten工具在GenBank中搜索sIgM同源序列，并使用UniProtandSMART对氨基酸结构域进行标注；S3.根据氨基酸序列结构，使用NJ法构建系统进化树；步骤五：实时荧光定量PCRS1.分别取大眼鳜头肾、脾脏、肝脏、鳃、肠、中肾、皮肤、脑、心，液氮速冻后，利用动物组织总RNA试剂盒提取总RNA，并用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒反转录得到cDNA模板；S2.根据已获得的sIgM重链基因cDNA序列设计荧光定量PCR引物，以β-actin基因为内参基因，利用SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒对cDNA序列进行扩增；S3.通过实时荧光定量PCR检测sIgM基因在大眼鳜不同组织中的表达，目的基因相对表达量的计算釆取ΔΔCT法。进一步的，步骤一S2所述的PCR扩增条件为：S1.95℃，预变性5min；S2.94℃变性30s,94℃变性30s，54℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环；S3.72℃延伸10min。进一步的，步骤四所述PCR扩增的反应条件为：S1.94℃变性5min；S2.94℃变性30s，72℃延伸2min，5个循环；S3.94℃变性30s，70℃复性30s，72℃延伸2min，5个循环；S4.94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；S5.72℃延伸8min，4℃终止。进一步的，步骤六S2所述的PCR扩增条件为：S1.95℃，预变性30s；S2.94℃变性5s，56℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环。进一步的，扩增得到的大眼鳜sIgM基因的sIgM重链基因cDNA序列全长为1952bp，其中起始密码子ATG的上游有49bp非编码区，终止密码子ATT下游有包含PolyA在内的151bp非编码区序列，开放阅读框长1752bp；所述PolyA上游20bp处是PolyA终止信号AATAAA。进一步的，扩增得到的大眼鳜sIgM重链基因cDNA序列还包括583个氨基酸，所述氨基酸包括一个可变区V，四个恒定区Cμ1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：总RNA提取和第一链cDNA的合成：/nS1.根据动物组织总RNA试剂盒说明书提取大眼鳜总RNA，选用经电泳和紫外分析检测条带清晰、完整性好的RNA用于反转录；/nS2.以总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，所得cDNA于-20℃保存备用；/n步骤二：IgM基因恒定区部分序列的扩增：/nS1.设计引物，根据NCBI中已知硬骨鱼类免疫球蛋白IgM基因保守区的cDNA序列设计引物IgM-F，IgM-R；/nS2.以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将所得目的条带回收，利用；/nS3.将经PCR扩增后的cDNA序列与PMD-19T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，经菌落PCR鉴定后，测序；/n步骤三：IgM全长cDNA的扩增：/nS1.新提取完整性好的大眼鳜头肾RNA，利用SMARTerRACE5'/3'Kit试剂盒反转录获得RACE模板；/nS2.根据已获得的中间片段设计5＇和3＇RACE引物，与UPM扩增大眼鳜IgM cDNA的5＇和3＇端；/nS3.将扩增后的产物经PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒纯化后与pRACE载体连接，转化到大肠杆菌DH5α株，菌落PCR检测阳性后测序；/nS4.将已获得的RNA片段、cDNA片段用DNAstar软件进行拼接并进行序列分析与比对，获得大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列，设计sIgM基因ORF引物对sIgM基因序列进一步的进行验证；/n步骤四：序列分析：/nS1.使用在线软件openreading frame finder预测氨基酸序列并寻找ORF；/nS2.用Blasten工具在GenBank中搜索sIgM同源序列，并使用UniProt and SMART对氨基酸结构域进行标注；/nS3.根据氨基酸序列结构，使用NJ法构建系统进化树；/n步骤五：实时荧光定量PCR：/nS1.分别取大眼鳜头肾、脾脏、肝脏、鳃、肠、中肾、皮肤、脑、心，液氮速冻后，利用动物组织总RNA试剂盒提取总RNA，并用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录得到cDNA模板；/nS2.根据已获得的sIgM重链基因cDNA序列设计荧光定量PCR引物，以β-actin基因为内参基因，利用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒对cDNA序列进行扩增；/nS3.通过实时荧光定量PCR检测sIgM基因在大眼鳜不同组织中的表达，目的基因相对表达量的计算釆取ΔΔCT法。/n...

【技术特征摘要】
1.大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：总RNA提取和第一链cDNA的合成：
S1.根据动物组织总RNA试剂盒说明书提取大眼鳜总RNA，选用经电泳和紫外分析检测条带清晰、完整性好的RNA用于反转录；
S2.以总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，所得cDNA于-20℃保存备用；
步骤二：IgM基因恒定区部分序列的扩增：
S1.设计引物，根据NCBI中已知硬骨鱼类免疫球蛋白IgM基因保守区的cDNA序列设计引物IgM-F，IgM-R；
S2.以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将所得目的条带回收，利用；
S3.将经PCR扩增后的cDNA序列与PMD-19T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，经菌落PCR鉴定后，测序；
步骤三：IgM全长cDNA的扩增：
S1.新提取完整性好的大眼鳜头肾RNA，利用SMARTerRACE5'/3'Kit试剂盒反转录获得RACE模板；
S2.根据已获得的中间片段设计5＇和3＇RACE引物，与UPM扩增大眼鳜IgMcDNA的5＇和3＇端；
S3.将扩增后的产物经PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒纯化后与pRACE载体连接，转化到大肠杆菌DH5α株，菌落PCR检测阳性后测序；
S4.将已获得的RNA片段、cDNA片段用DNAstar软件进行拼接并进行序列分析与比对，获得大眼鳜sIgM基因全长cDNA序列，设计sIgM基因ORF引物对sIgM基因序列进一步的进行验证；
步骤四：序列分析：
S1.使用在线软件openreadingframefinder预测氨基酸序列并寻找ORF；
S2.用Blasten工具在GenBank中搜索sIgM同源序列，并使用UniProtandSMART对氨基酸结构域进行标注；
S3.根据氨基酸序列结构，使用NJ法构建系统进化树；
步骤五：实时荧光定量PCR：
S1.分别取大眼鳜头肾、脾脏、肝脏、鳃、肠、中肾、皮肤、脑、心，液氮速冻后，利用动物组织总RNA试剂盒提取总RNA，并用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒反转录得到cDNA模板；
S2.根据已获得的sIgM重链基因cDNA序列设计荧光定量PCR引物，以β-actin基因为内参基因，利用SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒对cDNA序列进行扩增；
S3.通过实时荧光定量P...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏虎，罗玉双，陈宁琳，杨品红，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43