猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提出了分离的核酸、分离的多肽、微生物、筛选微生物的方法、猪繁殖与呼吸综合征疫苗及其制备方法、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物或者试剂盒中的用途和试剂在制备试剂盒中的用途。与SEQ ID NO：1相比，该分离的核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。发明专利技术人通过将JK100病毒在Marc‑145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒，该病毒在机体内可以实现短时间诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，起到较好地免疫应答效果。

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, vaccine and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物医药领域。具体地，本专利技术涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)俗称猪蓝耳病，在世界范围内广泛存在。PRRS于1987年在美国首次发生，分别在1991年欧洲和1992年美国分离到病原。1992年5月世界动物卫生组织将该病列为B类传染病。我国是在1996年由郭宝清首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，目前被我国列为“二类传染病”。PRRS在临床上表现为妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状，并伴随生长缓慢病死率高等。但是该病可以表现为隐性感染和持续感染，同时导致猪免疫机能降低，还能跟其它多种病原微生物共同作用，造成其他相关疾病，给该病的防治造成极大困难。PRRSV有两大显著的免疫学特征，同时也是PRRS防控中遇到的最大难题。一是抗体依赖的感染增强作用(ADE)，即低水平抗体的存在，不是提供保护，而是介导和加强感染。猪在感染PRRSV后会迅速产生抗体应答，但感染早期产生的抗体主要是非中和抗体，而低水平的中和抗体直到感染后4周左右才能检测到，这就导致了ADE作用。二是持续性感染，即猪机体内病毒的持续存在和病原污染场内感染猪群的持续性存在。PRRSV引起的持续感染，可能是通过阻碍机体内干扰素的诱导和/或通过专嗜性细胞中抗病毒蛋白活性来逃避机体的免疫。细胞免疫监视系统不易将病毒从感染猪体中清除，从而导致长期的病毒血症和持续感染的原因。研究表明：PRRS病毒GP5蛋白是最主要的保护性抗原蛋白，能够诱导产生较高水平的中和抗体。GP5蛋白的外功能区包含一个非中和表位(A表位)和一个中和表位(B表位)，诱骗表位(decoyepitop)A表位的存在导致机体降低对中和表位B表位的免疫应答，此外B表位上及其周围的糖基化位点也降低了其免疫原性。PRRSV感染后抑制IFN-a的产生以降低风险信号的水平，诱导机体产生非中和活性的多个克隆抗体，并通过GP5蛋白上N端糖基化位点掩盖中和表位，延迟中和抗体的产生，这是病毒建立免疫逃避以及形成持续性感染的主要机制。然而，目前能够在短时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应的病毒仍有待开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：专利申请号为CN00121274.5的中国专利申请中公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒JK100。但是，其病毒效价低，以此制备成的疫苗保护效果不好，反而有引起ADE的危险。现有市售的经典株蓝耳弱毒活疫苗为VR2332株、Ch-1R株、R98株，这些疫苗也存在免疫初期中和抗体和细胞免疫产生时间晚(28天)、抗体水平达不到一定阈值的情况下、引发ADE作用等问题。有鉴于此，专利技术人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，不仅可以提高病毒的滴度，并且造成了病毒在GP5蛋白上诱骗表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，与SEQIDNO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。专利技术人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(本专利技术亦称作“JK101病毒”)。与JK100病毒相比，JK101病毒的GP5基因上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种分离的多肽。根据本专利技术的实施例，与SEQIDNO：2相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V。专利技术人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得的JK101病毒与JK100病毒相比，GP5基因编码的多肽上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种微生物。根据本专利技术的实施例，所述微生物具有前面所述的分离的核酸和/或前面所述的分离的多肽。专利技术人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种微生物—JK101病毒，该病毒与JK100病毒相比，GP5基因上产生突变，且由该基因编码的多肽也产生突变，造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。根据本专利技术的实施例，所述微生物为病毒，于2018年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15472。在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种筛选微生物的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，以便得到传代后的微生物；对所述传代后的微生物进行特定基因序列分析及所述特定基因编码的氨基酸序列分析，其中，与SEQIDNO：1相比，所述特定基因序列具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G；和/或与SEQIDNO：2相比，所述氨基酸序列具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V是所述候选微生物作为目标微生物的指示。由此，利用本专利技术的方法能够筛选出可以获得具有上述基因和多肽突变的猪繁殖与呼吸综合征病毒的初始病毒(即目标微生物)，并且该方法操作简便，适于规模化应用。根据本专利技术的实施例，所述传代后的微生物为前面所述的微生物。根据本专利技术的实施例，所述交替传代是采用下述方式进行的：动物肺脏内传代3次，Marc-145细胞内传代4次，动物肺脏内传代5次，Marc-145细胞内传代3次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代2次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代1次，动物肺脏内传代9次，Marc-145细胞内传代1次。根据本专利技术的实施例，在进行所述交替传代之前，将所述候选微生物进行如下处理：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸，其特征在于，与SEQIDNO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。


2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDNO：2相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V。


3.一种微生物，其特征在于，所述微生物具有权利要求1所述的分离的核酸和/或权利要求2所述的分离的多肽；
任选地，所述微生物为病毒，于2018年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15472。


4.一种筛选微生物的方法，其特征在于，包括：
使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，以便得到传代后的微生物；
对所述传代后的微生物进行特定基因序列分析及所述特定基因编码的氨基酸序列分析，
其中，与SEQIDNO：1相比，所述特定基因序列具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G；和/或
与SEQIDNO：2相比，所述氨基酸序列具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V是所述候选微生物作为目标微生物的指示；
任选地，所述传代后的微生物为权利要求3所述的微生物；
任选地，所述交替传代是采用下述方式进行的：
动物肺脏内传代3次，Marc-145细胞内传代4次，动物肺脏内传代5次，Marc-145细胞内传代3次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代2次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代1次，动物肺脏内传代9次，Marc-145细胞内传代1次；
任选地，在进行所述交替传代之前，将所述候选微生物进行如下处理：
将所述候选微生物在Marc-145细胞中传代10～20代，以便得到增殖的微生物；
将所述增殖的微生物注入动物体...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，孔杨，沈元，崔玉娟，柴强强，
申请(专利权)人：北京中联康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11