烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草

Ntmyb12 gene of tobacco and its application in regulating fatty acid synthesis

【技术实现步骤摘要】
烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用
本专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草NtMYB12基因及其在调控脂肪酸合成中的应用专利申请。
技术介绍
植物中脂肪酸（Fattyacids，FA）的分布非常广泛、种类繁多、含量丰富，在植物多个生理过程中发挥着重要的功能，例如作为主要成分组成植物分泌的蜡质和植物表皮角质层，有效防止外部机械损伤、热量和水分散失及病原菌侵害；植物细胞膜脂中不饱和脂肪酸含量升高，膜脂相变温度会相应降低，从而增加细胞膜的流动性，使植物的抗寒性有所提高；脂肪酸还可以作为重要的信号分子参与信号转导过程、参与对植物生长发育的调控及对各种逆境胁迫的响应和适应；脂肪酸还是各种含油种子的子叶和胚乳中重要的存储物质，为种子萌发过程提供能量；同时植物脂肪酸是人类油脂的重要来源之一，为人类提供营养和能量。而就栽培烟草（NicotianatabacumL.）而言，其中的脂肪酸又可分为挥发性低级脂肪酸和半挥发性高级脂肪酸两大类，其中亚油酸和亚麻酸会增加烟叶的刺激性，而碳原子在12以上的各类高级脂肪酸则可赋予烟叶特殊的香气，对烟叶的品质和风味有重要的影响。已有研究表明，植物脂肪酸的合成受多种因素的影响，包括转录调控、植物激素和环境因子等。而仅就转录调控而言，在不同组织结构部位所参与的转录因子类型也是不同的。转录因子MYB12作为一种转录调控因子，已有研究多认为该转录因此能够促进类黄酮的合成，其调控功能是通过与MYB11和MYB111形成蛋白复合体，通过直接促进查尔酮合酶基因（chalconesynthase，CHS）、查尔酮异构酶基因（chalconeisomerase，CHI）、黄烷酮-3-羟化酶基因（flavonol3-hydroxylase，F3H）、类黄酮-3’-羟化酶基因（flavonol3’-hydroxylase，F3’H）和黄酮醇合酶基因（flavonolsynthase，FLS）的表达来实现的。但近年来研究也表明转录因子MYB12具有多种调节功能，与植物的多种生理和代理调节具有高度关联。也因此，对于该基因功能的进一步深入研究，可为植物生长调控和作物新品种培育奠定一定技术基础。
技术实现思路
基于对烟草NtMYB12基因的初步研究，本专利技术的目的在提供烟草NtMYB12转录因子再脂肪酸合成中的新应用，从而为作物代谢产物调控、新品种培育奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。烟草NtMYB12基因，全长2530bp，其中编码区全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。所述烟草NtMYB12基因在种子脂肪酸合成中的应用，利用基因沉默技术、基因编辑或者基因超表达方法，通过调节烟草NtMYB12基因表达量，来调节控制烟草种子中脂肪酸含量情况。含有所述NtMYB12基因的超表达载体，以pCAMBIA1301质粒作为载体，通过与NtMYB12基因的CDS全长序列进行重组制备获得，所述NtMYB12基因的CDS全长序列，具体PCR扩增时，PCR扩增用引物序列设计为：NtMYB12a-SpeI-F：5’-AGAGACTAGTATGGGAAGA—GCACCTTGTTGTG-3’，NtMYB12a-KpnI-R：5’-TGACGGTACCAGACAAAAGCC—AAGCGACAA-3’。针对NtMYB12基因的RNAi表达载体，以pHellsgate2为质粒载体，以NtMYB12基因中的部分CDS序列为目标序列，构建过程中，针对NtMYB12基因中的部分CDS序列，具体PCR扩增用引物序列设计为：NtMYB12a-R-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAGCCGACCCTCAGTAAAGA-3’，NtMYB12a-R-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCATTCC—ATCCCACTATCTGAA-3’。所述烟草NtMYB12基因的PCR制备方法，具体包括如下步骤：（一）基因组提取，（二）设计引物，并进行PCR扩增设计特异性扩增引物对如下：NtMYB12-F：5’-ATGGGAAGAGCACCTTGTTGTG-3’，NtMYB12-R：5’-GACAAAAGCCAAGCGACAA-3’。利用所述烟草NtMYB12基因的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtMYB12基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得种子脂肪酸含量变化的烟草新品种；具体例如：基于基因工程中相关技术，利用超表达载体pCAMBIA1301、或RNAi载体pHellsgate2，构建获得含有NtMYB12基因中CDS序列的重组超表达载体、或者针对NtMYB12基因中CDS序列的RNAi载体，然后转化烟草植株，筛选获得种子中脂肪酸含量变化的植物新品种。换言之，一种培育种子低脂肪含量/高脂肪酸含量含量烟草新品种培育方法，利用超表达载体pCAMBIA1301、或RNAi载体pHellsgate2来对NtMYB12基因表达量进行调节，从而获得种子中脂肪酸含量明显变化的烟草新品种。烟草NtMYB12基因所编码NtMYB12转录蛋白，对应NtMYB12基因中的1254bp长度的编码区，由417个氨基酸构成，该蛋白在细胞内定位为细胞核内，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。烟草NtMYB12转录蛋白在脂肪酸合成调控中的应用，该转录蛋白表达量或含量升高后，脂肪酸含量降低；而降低该转录蛋白含量后，脂肪酸含量升高。本申请中，专利技术人通过对烟草NtMYB12基因的初步研究，发现其所编码的NtMYB12转录蛋白定位在细胞核内。进一步通过对该基因的沉默和超表达的功能验证，结果表明该基因与种子脂肪酸合成紧密关联。基于此，可为植株生理代理调节、新品种培育奠定良好技术基础。附图说明图1烟草NtMYB12的亚细胞定位分析；NLS为已知的核定位蛋白，NtMYB12-GFP融合蛋白的位置与NLS完全重合，表明该融合蛋白也定位在细胞核中；图2不同烟草组织中NtMYB12基因的表达模式分析及其表达载体构建；（a）盛花期不同组织器官中NtMYB12基因的表达水平；（b）NtMYB12基因结构及其过表达、RNAi载体、基因编辑位点示意图；（c）过表达和RNAi中NtMYB12基因的转录水平；（d）基因编辑植株突变体的高通量测序鉴定；图3NtMYB12促进烟草类黄酮的合成；野生型、NtMYB12过表达、NtMYB12-RNAi和NtMYB12基因编辑突变体的花序表型（a）、花青素含量（b）、黄酮醇含量（c）和绿原酸含量含量（d）；图4NtMYB12抑制烟草种子中脂肪酸的合成；NtMYB12过表达、NtMYB12-RNAi和NtMYB12基因编辑突变体的种子形态（a）、种子千本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.烟草

【技术特征摘要】
1.烟草NtMYB12基因，其特征在于，该基因全长2530bp，其中编码区全长1254bp，包含3个内含子和4个外显子，其碱基序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述烟草NtMYB12基因在种子脂肪酸合成中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术、基因编辑或者基因超表达方法，通过调节烟草NtMYB12基因表达量，来调节控制种子中脂肪酸含量情况。


3.含有权利要求1所述NtMYB12基因的超表达载体，其特征在于，以pCAMBIA1301质粒作为载体，通过与NtMYB12基因的CDS全长序列进行重组制备获得，所述NtMYB12基因的CDS全长序列，具体PCR扩增时，PCR扩增用引物序列设计为：
NtMYB12a-SpeI-F：5’-AGAGACTAGTATGGGAAGA—GCACCTTGTTGTG-3’，
NtMYB12a-KpnI-R：5’-TGACGGTACCAGACAAAAGCC—AAGCGACAA-3’。


4.针对权利要求1所述NtMYB12基因的RNAi表达载体，其特征在于，以pHellsgate2为质粒载体，以NtMYB12基因中的部分CDS序列为目标序列，构建过程中，针对NtMYB12基因中的部分CDS序列，具体PCR扩增用引物序列设计为：
NtMYB12a-R-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAGCCGACCCTCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王中，杨军，武明珠，李锋，谢小东，张剑锋，李泽锋，罗朝鹏，魏攀，王晨，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41