本发明专利技术提供一种新型的碱性蛋白酶突变体，以来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因subC为基础，通过定点突变PCR技术获得了2个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。
A new high temperature mutant of alkaline protease from Bacillus licheniformis
【技术实现步骤摘要】
一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体
本专利技术属于蛋白中工程改造领域，具体涉及一种新型的碱性蛋白酶突变体蛋白。
技术介绍
碱性蛋白酶(alkalineprotease)指在碱性条件下(pH在9～11范围内)能够水解蛋白质肽键的酶，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。目前所采用的碱性蛋白酶多是经细菌原生质体诱变方法造育的来源于枯草芽孢杆菌2709通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果，，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60％左右。定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向编码目的蛋白的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题提供了一种在较高温度条件下酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)碱性蛋白酶基因subC的成熟肽出发，运用定点突变技术获得的，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。本专利技术一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:1的碱性蛋白酶的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQIDNO:2。本专利技术一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO:2的碱性蛋白酶的第306位氨基酸由Gly变为Cys，突变体氨基酸序列为SEQIDNO:3。本专利技术以来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶subC为基础，通过定点突变技术获得了两个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并在枯草芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。附图说明图1：碱性蛋白酶表达载体的质粒图谱；图2：碱性蛋白酶突变体经热处理后的相对酶活柱形图。具体实施方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，实现本专利技术的方法不应限于本专利技术实施例所记载的具体方法步骤。对于本专利技术所涉及的术语及相关测定方法解释如下：1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)。2、酶活单位的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。4、、碱性蛋白酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Ala283Ile，表示位置283的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Ala替换成Ile，位置的编号对应于附件序列表SEQIDNO:1中的编号。如Ala283Ile/Gly306Cys，表示位置283和位置306的氨基酸都发生了突变。实施例1碱性蛋白酶subC表达载体及重组菌株的构建以pMA5质粒作为模板，通过pMA5上游引物5’-taataaatgagttatgcagtttgtagaatgc-3’和pMA5下游引物5’-taaatcgctcctttttaggtggcaca-3’PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。以地衣芽孢杆菌基因组DNA作为模板，通过subC上游引物5’-ATGATGCGCAAAAAAAGCTTCTGGC-3’和subC下游引物5’-CTGGGCGGCAGCTTCAACGTTGAT-3’PCR扩增subC完整基因，从而获得携带信号肽及成熟肽的碱性蛋白酶序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：1。上述PCR扩增条件为：94℃10min；94℃60s，58℃60s，72℃2min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtractionKit回收PCR扩增产物。将回收获得的酶基因序列及载体骨架序列重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下：5×PhusionHFBuffer10μL，2.5mMdNTPs8μL，基因片段(subC片段)4μL，载体骨架片段(pMA5)6μL，PhusionDNAPolymerase1μL，ddH2O21μL。扩增条件为98℃10min；98℃10s，72℃3min，20个循环；98℃10s，72℃6min，15个循环；72℃10min。将多聚体转化Bacillussubtilis1A751(来源于BGSC)宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶subC的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌subC(BacillussubtilissubC)。提取枯草芽孢杆菌subC里的质粒，将其命名为pMA5-subC(含有野生型subC基因)，其质粒图谱如附图1所示。上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1A751是本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于所述的碱性蛋白酶突变体的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2。/n
【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于所述的碱性蛋白酶突变体的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQIDNO:2。
2.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的第306位氨基酸由Gly变为Cys，突变体氨基酸序列为SEQIDNO:3。
3.一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，付刚，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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