抗EGFRvIII抗体及其在疾病诊断或治疗中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种针对表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII）的抗体或其片段，所述抗体或其片段能够以高亲和力特异性结合EGFRvIII，可用于肿瘤或癌症的治疗或诊断。本发明专利技术的抗体优选为嵌合抗体，具有人IgG1和kappa型恒定区。本发明专利技术还提供编码该抗体或其片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体、用该载体转化的细胞、包含前述任一的药物组合物以及各个主题的癌症预防或诊断应用。

Anti egfrv III antibody and its application in disease diagnosis or treatment

【技术实现步骤摘要】
抗EGFRvIII抗体及其在疾病诊断或治疗中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，本专利技术涉及针对表皮生长因子受体（EGFR）的缺失突变体（变体III）的特异性结合分子，特别是抗体或其片段，以及该特异性结合分子在肿瘤或癌症诊断和治疗中的应用。
技术介绍
表皮生长因子受体（EGFR）是原致癌基因c-erbB的170,000道尔顿的膜糖蛋白产物。已证实EGFR在多种类型的人实体肿瘤中过量表达，例如已在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌中均观察到了EGFR的过量表达，并且证实表皮生长因子（EGF）和转化生长因子-α（TGF-α）都结合至EGFR，而且导致细胞增殖和肿瘤生长。包含显著比例的EGFR基因扩增的肿瘤也共表达截短形式的EGFR，其中最常见的为EGFR的缺失突变体即变体III（EGFRvIII）。EGFRvIII也可称为de2-7EGFR、ΔEGFR或Δ2-7，这些术语在本文可互换使用。EGFRvIII的特征为，由于EGFR基因的外显子2-7缺失，导致相应的蛋白EGFRvIII缺失第6-273位氨基酸残基（编号根据成熟的EGFR），并且在融合连接处产生新的Gly残基。EGFRvIII的这一缺失连同Gly的插入一起在缺失界面上产生了独特的连接肽。EGFRvIII已在许多肿瘤类型中得到报道，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等。虽然这种截短受体不结合配体，但研究证明，它由于具有低组成型活性而促进肿瘤进展，并且已有实验证明癌细胞对EGFRvIII表达具有依赖性。因此，EGFRvIII已经成为癌症治疗或诊断的合适靶标，特别是与EGFRvIII表达或EGFR过表达有关的实体瘤疾病中。EGFRvIII作为肿瘤特异性抗原，针对其的抗体已经得到多项开发和应用。已知的EGFRvIII抗体包括L8A4、AMG595、AFM-22等，但在EGFRvIII特异性及ADCC活性上均有待提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，通过EGFRvIII中表位作为免疫原免疫动物，并经过B细胞选择技术，获得特异性结合分子，该分子对人EGFRvIII具有高特异性且对EGFRvIII表达细胞具有显著的抗体依赖性细胞介导的毒性作用。因此，本专利技术的目的是提供一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段。相比于现有EGFRvIII抗体，所提供的抗体具有更好的抗原结合活力和ADCC、ADCP等活性。本专利技术的技术方案如下：一方面，本专利技术提供一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有示于SEQIDNO:4的重链可变区（VH）和示于SEQIDNO:8的轻链可变区（VL）。本专利技术提供的抗体或其抗原结合片段针对人EGFRvIII，优选与人EGFRvIIIPEP3（SEQIDNO:9）结合；并且所述抗体或其抗原结合片段不结合EGFR。优选地，本专利技术提供的抗体为单克隆抗体或单链抗体，其中所述单克隆抗体具有重链（HC）和轻链（LC）。优选地，本专利技术提供的抗体为鼠源抗体或嵌合抗体；其中更优选为嵌合抗体，所述嵌合抗体优选具有IgG1型的重链恒定区（CH）和kappa型的轻链恒定区（CL）。根据本专利技术的具体实施方式，所述嵌合抗体具有示于SEQIDNO:10的重链恒定区（CH）和示于SEQIDNO:11的轻链恒定区（CL）。本专利技术提供的抗体或其抗原结合片段可以利用本领域已知的任何方法获得。根据本专利技术的具体实施方式，可以在分别获得编码本专利技术抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列后，将其与编码所选择的重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列分别进行搭桥PCR并连接到pcDNA3.1/GS质粒，进而将构建好的轻重链质粒共转染到CHO-K1细胞中进行表达，经ProteinA纯化获得本专利技术的抗体。另一方面，本专利技术提供一种核酸分子，其核苷酸序列编码本专利技术任意抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，所述核苷酸序列示于SEQIDNO:20和SEQIDNO:22。或者，其核苷酸序列编码本专利技术任意抗体或其抗原结合片段中的重链和轻链的氨基酸序列，所述核苷酸序列示于SEQIDNO:21和SEQIDNO:23。还一方面，本专利技术提供一种包含所述核酸分子的载体。所述载体例如真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。根据本专利技术的具体实施方式，所述载体为pcDNA3.1/GS质粒，空白质粒的核苷酸序列示于SEQIDNO:24。本专利技术的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，另一方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本专利技术的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本专利技术的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。根据本专利技术的具体实施方式，所述宿主细胞为被本专利技术的上述载体转染的CHO-K1细胞。又一方面，本专利技术提供所述抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞在制备用于治疗肿瘤或癌症的药物中的用途，所述肿瘤或癌症与EGFRvIII过表达相关，或者所述肿瘤或癌症的细胞中过表达EGFRvIII。优选地，所述肿瘤或癌症为神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。此外，本专利技术还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术提供的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、载体或宿主细胞。所述试剂盒可用于诊断肿瘤或癌症，所述肿瘤或癌症与EGFRvIII过表达相关，或者所述肿瘤或癌症的细胞中过表达EGFRvIII。优选地，所述肿瘤或癌症为神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。本专利技术提供了一种能够以更高亲和力特异性结合EGFRvIII的抗体，该抗体不与EGFR相结合；相比于现有抗体，该抗体具有针对表达EGFRvIII的靶细胞的更高ADCC、ADCP活性，因此可以作为与EGFRvIII表达相关的肿瘤或癌症的治疗或诊断手段。此外，本专利技术提供的抗体还可以与其他化学治疗剂或抗癌剂或者与其他抗体或其片段组合用于所述肿瘤或癌症的治疗中。附图说明以下结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中：图1显示了本专利技术的抗EGFRvIII嵌合抗体与人EGFRvIIIPEP3的结合活性。图2显示了本专利技术的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFR表达靶细胞的ADCC活性。图3显示了本专利技术的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFRvIII表达细胞的ADCC活性。图4显示了本专利技术的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFR表达靶细胞的ADCP活性。图5显示了本专利技术的抗EGFRvIII嵌合抗体与EGFRvIII表达细胞的ADCP活性。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有示于SEQ ID NO: 4的重链可变区和示于SEQ ID NO: 8的轻链可变区。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗人EGFRvIII的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有示于SEQIDNO:4的重链可变区和示于SEQIDNO:8的轻链可变区。


2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。


3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体为嵌合抗体，其在重链中具有IgG1型的重链恒定区和在轻链中具有kappa型的轻链恒定区。


4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区示于SEQIDNO:10，所述轻链恒定区示于SEQIDNO:11。


5.一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列编码权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，所述核苷酸序列示于SEQIDNO:20和SEQIDNO:22。


6.一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊新辉，张弢，仲恺，吴伟，
申请(专利权)人：南京诺艾新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32