一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法，其中，疫苗包含啤酒酵母外壳葡聚糖葡聚糖GP、佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和多肽M30，分别按照1:20‑25:10‑12的质量比进行连接。本发明专利技术提供了一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法，克服了现有技术中MHCⅠ类分子与短肽结合不能激活CD4

A mouse tumor vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法
本专利技术涉及疫苗开发
，特别是涉及一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法。
技术介绍
目前，肿瘤疫苗的研究呈现白炽化状态，进入2017年，PD-1疗法囊括多个适应症；CAR-T治疗在获得FDA专委会推荐后，成为免疫治疗又一里程碑事件，但是PD-1/PD-L1药物的作用机制非常复杂，受益群体相对有限，部分患者还可能存在耐药和加速进展的风险；而CAR-T疗法涉及基因工程改造，还可能会引发细胞因子风暴，而且靶点过于单一，且在实体瘤中效果不佳。为此，学者们努力尝试寻找新的治疗方法，以弥补上述两种免疫疗法的不足。研究肿瘤新抗原，并借此开发个性化肿瘤疫苗，就成为了一个重要而又热门的方向。全球癌症疫苗研究已有近20年的历史，目前在美国ClinicalTrials.gov注册CancerVaccine的临床研发项目累计多达947项。2011年前后，肿瘤疫苗产品的研发达到一段黄金期。2013年下半年以来，多个重磅疫苗的三期临床试验遭遇滑铁卢，在耗费大量精力财力后，不得不放弃，其中不乏Stimuvax(靶向MUC1，默克公司)以及GSK1572932A(靶向MAGE-A3，GSK)这样的具有知名度的产品。即便是被FDA批准上市的首个肿瘤疫苗Provenge，也因为成本和有效性的问题，暂时被搁置。从研发策略来看，这些疫苗选择的都是肿瘤相关性抗原(TAA)。TAA是机体自身具有的蛋白(只是在癌症细胞上大量表达而已)，因此病人对这些抗原应该是早就有“中枢免疫耐受”了。因此无论如何刺激，也不能达到疗效。所以这类被称为“癌症相关抗原”的蛋白并非理想“抗原”。在肿瘤疫苗研制方面所面临的问题有：疫苗很难找到理想的、能够诱发强烈免疫应答的癌细胞抗原，且癌症疫苗没有绕过复杂的免疫机制，高度依赖患者的免疫系统状态和肿瘤状态，目前无法成为主导性的治疗方式；同时癌症疫苗针对一个或几个癌细胞靶点发挥作用，但癌细胞高度可变，随时变异。而在用肿瘤相关抗原来制备抗肿瘤疫苗时也会产生新的问题，如自身抗原具有免疫耐受，很难诱导免疫反应，免疫原性很低或诱发免疫反应之后容易导致免疫性疾病的风险。随着新技术的发展，neoantigen(肿瘤新抗原)逐步进入科学家视野，它通常由肿瘤细胞基因组突变产生，仅存在肿瘤细胞，所以又称为肿瘤特异性抗原(TSA)。由于正常细胞不会产生和表达TSA，所以能更有效的激发机体免疫反应。《Nature》杂志同期发表两项独立临床I期试验结果，就是通过对肿瘤细胞进行DNA和RNA测序，寻找肿瘤细胞因基因突变而特异表达的neoantigen，然后构建个性化的肿瘤疫苗，回输到体内激活免疫细胞，并杀死带有上述抗原的肿瘤细胞。随着NGS测序技术的发展，筛选肿瘤特异性抗原实现了技术上的突破。2013年，Rosenberg团队率先利用外显子技术，在肿瘤细胞系上发现neoantigens，并验证了其免疫反应。通过使用NGS技术和构建算法模型，外显子测序和转录组测序能准确表征肿瘤细胞的DNA和RNA，找出可能引起免疫细胞识别的肿瘤突变，生物信息学工具的发展则提高了肿瘤新生抗原的筛选能力，基因组大数据和计算机算法加速了肿瘤表位预测以及MHC(主要组织相容性复合体)亲和力预测，推动了个体化肿瘤疫苗的发展。目前，个体化疫苗的核心问题是免疫策略，当前占有主流地位的方法是长肽免疫(多肽加PolyIC佐剂)和RNA免疫(新抗原多肽编码的RNA)，利用RNA转染直接免疫。利用多肽直接做抗原进行免疫，具有更好的针对性和特异性以及能够有效应对肿瘤突变抗原的免疫应答，如M30多肽，其中M30多肽小鼠肿瘤细胞系B16F10突变基因筛选第30号的突变基因对应合成的多肽片段，由于受到HLA的限制，使得不表达共有型HLA的患者不能接受多肽疫苗的治疗。此外，常见的MHCⅠ类分子与短肽结合不能激活CD4+T细胞，这就限制了CD8+细胞毒T细胞的效应。因此，针对上述技术缺陷，专利技术一种小鼠肿瘤疫苗，克服现有技术中MHCⅠ类分子与短肽结合不能激活CD4+T细胞的技术缺陷，使得小鼠肿瘤疫苗具有抑制肿瘤生长的功能是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种小鼠肿瘤疫苗及其制备方法，克服了现有技术中MHCⅠ类分子与短肽结合不能激活CD4+T细胞的技术缺陷，首次通过引入特异性的肿瘤佐剂，实现了激活CD4+T细胞的目的，使得小鼠肿瘤疫苗具有抑制肿瘤生长的功能；同时对用于治疗人类肿瘤疫苗的研发提供新的思路和基础。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种小鼠肿瘤疫苗，包含啤酒酵母外壳葡聚糖GP、佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和多肽M30；其中所述啤酒酵母外壳葡聚糖GP、所述佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和所述多肽M30分别按照1:20-25:10-12的质量比进行连接，得到GP—Poly(I:C)—M30小鼠肿瘤疫苗。其中，酒酵母外壳葡聚糖GP的制备方法如下：(1)取5袋(15g/袋)安琪高效活性干酵母置于1L玻璃烧杯中，加入1L去离子水重悬酵母。(2)将重悬酵母溶液置于离心瓶中并配平，2000rpm离心5min，弃上清。再次加入去离子水重复洗涤两次(去除酵母中的添加剂)。(3)收集酵母菌体至烧杯中，加入1LNaOH(1M/L)置于磁力搅拌器上90℃加热搅拌1h。(4)5000rpm离心5min，收集沉淀。加入900mL去离子水后，用盐酸调pH至4.5，并定容至1L，然后置于磁力搅拌器上75℃加热搅拌1h。(5)离心收集沉淀，去离子水洗涤3次。(6)5000rpm离心5min，收集沉淀。异丙醇洗涤4次。(7)离心收集沉淀，丙酮洗涤2次。(8)将沉淀放置于通风厨中干燥，然后收集白色粉末置于容器内备用。本专利技术克服了现有技术中MHCⅠ类分子与短肽结合不能激活CD4+T细胞的技术缺陷，通过引入特异性的肿瘤佐剂，实现了激活CD4+T细胞的目的，使得小鼠肿瘤疫苗具有抑制肿瘤生长的功能；同时对用于治疗人类肿瘤疫苗的研发提供新的思路和基础。一种小鼠肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)称取GP至EP管中，向管中接入1-5ml油相溶液，至GP的浓度为5mg/ml置于超声波清洗仪超声分散50min。(2)向管中加入荧光标记的多肽M30溶液和Poly溶液，搅拌过夜。(3)取5-10μl0.5％的壳聚糖溶液，加入到200-250μl油相溶液中混匀，然后将其与步骤(2)中的溶液混匀，并继续搅拌2-3h。(4)取5-10μl1％的戊二醛溶液，加入到200-250μl油相溶液中混匀，然后将其混匀加入到(3)中的溶液，继续搅拌2-3h，(5)5000rpm，离心5-10min，收集目的油相溶液1-5ml备用。(6)利用环己烷洗涤步骤(5)所述目的油相溶液3次去除Igepal，并利用空气泵吸取所述目的油相溶液后利用PBS洗涤3次，并加入1-2ml的PBS重悬，置于-20℃备用。进一步的，所述油相溶液为环己烷与Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠肿瘤疫苗，其特征在于，包含啤酒酵母外壳葡聚糖GP、佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和多肽M30；其中所述啤酒酵母外壳葡聚糖GP、所述佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和所述多肽M30分别按照1:20-25:10-12的质量比进行连接，得到GP—Poly(I:C)—M30小鼠肿瘤疫苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肿瘤疫苗，其特征在于，包含啤酒酵母外壳葡聚糖GP、佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和多肽M30；其中所述啤酒酵母外壳葡聚糖GP、所述佐剂聚肌胞苷酸Poly(I:C)和所述多肽M30分别按照1:20-25:10-12的质量比进行连接，得到GP—Poly(I:C)—M30小鼠肿瘤疫苗。


2.根据权利要求1所述的一种小鼠肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取GP至EP管中，向管中接入1-5ml油相溶液，至GP的浓度为5mg/ml置于超声波清洗仪超声分散50min；
(2)向管中加入荧光标记的多肽M30溶液和Poly溶液，搅拌过夜；
(3)取5-10μl0.5％的壳聚糖溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伯清，贾正虎，
申请(专利权)人：天津贝罗尼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12