用于从3-甲基巴豆酸产生异丁烯的改进方法技术

描述了用于产生异丁烯的方法，所述方法包括使3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生的辅因子，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAP：(i)使二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)酶促转化成所述DMAP；或(ii)其中使异戊烯醇(prenol)直接酶促转化成所述DMAP的单个酶促步骤；或(iii)两个酶促步骤，包括：首先使DMAPP酶促转化成异戊烯醇；并且随后使如此获得的异戊烯醇酶促转化成所述DMAP；或(iv)使异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成所述DMAP，或通过(i)至(iv)中任一者的组合。另外，描述了用于产生异丁烯的方法，所述方法包括使3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中利用二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAPP：(v)使异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成所述DMAPP；或(vi)使二甲基烯丙基磷酸(DMAP)酶促转化成所述DMAPP；或(vii)使异戊烯醇酶促转化成所述DMAPP；或(viii)通过(v)至(vii)中任一者的组合。另外，描述了通过使核黄素酶促转化成黄素单核苷酸(FMN)，酶促提供所述黄素辅因子的方法。

An improved method for the production of isobutylene from 3-methylcrotonic acid

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从3-甲基巴豆酸产生异丁烯的改进方法本专利技术涉及用于产生异丁烯的方法，所述方法包括使3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生的辅因子，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAP：(i)使二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)酶促转化成所述DMAP；或(ii)其中使异戊烯醇(prenol)直接酶促转化成所述DMAP的单个酶促步骤；或(iii)两个酶促步骤，包括：首先使DMAPP酶促转化成异戊烯醇；并且随后使如此获得的异戊烯醇酶促转化成所述DMAP；或(iv)使异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成所述DMAP，或通过(i)至(iv)中任一者的组合。另外，本专利技术涉及用于产生异丁烯的方法，所述方法包括使3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中利用二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAPP：(v)使异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成所述DMAPP；或(vi)使二甲基烯丙基磷酸(DMAP)酶促转化成所述DMAPP；或(vii)使异戊烯醇酶促转化成所述DMAPP；或(viii)通过(v)至(vii)中任一者的组合。另外，本专利技术涉及通过使核黄素酶促转化成黄素单核苷酸(FMN)，酶促提供所述黄素辅因子的方法。许多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或例如其他戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业和在化学工业其他领域和燃料领域中使用。丁烯以四种形式存在，其中之一，异丁烯(又称作异丁烯)，进入甲基叔丁基醚(MTBE)(汽车燃料用抗爆添加剂)的组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛烯，所述异辛烯转而可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。烯类如异丁烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭或天然气中通过Fischer-Tropsch法的衍生物)产生。生产成本因此与油价紧密相关。另外，催化性裂解有时与增加工艺复杂性和生产成本的巨大技术难题相关。在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯类如异丁烯。由于发酵和蒸馏过程已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成。第二代生物燃料的生产处于探索期，尤其包括生产长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链链烷和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总体概述：Ladygina等人(ProcessBiochemistry41(2006),1001)和Wackett(CurrentOpinionsinChemicalBiology21(2008),187)。已经描述异戊酸由小红酵母(Rhodotorulaminuta)转化成异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但是这种反应的效率，小于每分钟百万分之一或每天约1/1000，远未允许工业应用。反应机理由FukudaH等人(BBRC201(1994),516)阐明并且涉及通过还原氧代铁基(oxoferryl)FeV＝O，使异戊酸脱羧的细胞色素P450酶。通过这种途径大规模生物合成异丁烯似乎是高度不利的，因为它将需要合成和降解一分子的亮氨酸以形成一分子的异丁烯。另外，催化此反应的酶使用血红素作为辅因子，这不利于其自身在细菌中的重组表达和酶参数的改善。出于全部这些原因，似乎很不可能的是，这种途径可以充当工业利用的基础。已经将其他微生物描述为能够略微地从异戊酸盐天然产生异丁烯；获得的产率甚至低于用小红酵母获得的那些产率(Fukuda等人(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和vanLeeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述通过酶促转化从乙酰乙酰基-CoA产生异丁烯，其中所提出途径的最后步骤是通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称作3-羟异戊酸(HIV))。WO2010/001078中也描述了从3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的这种反应。在Gogerty等人(见上述引文)和vanLeeuwen等人(见上述引文)中，提出通过转化3-甲基-巴豆酰-CoA经3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，实现3-羟基-3-甲基丁酸的产生。为了进一步改善从可再生资源产生异丁烯的方法的效率和变异性，已经通过提供用于产生异丁烯的方法开发了提供异丁烯及其前体的备选途径，所述方法包括使3-甲基巴豆酸(也称作3-甲基-2-丁烯酸，3,3-二甲基丙烯酸或千里光酸)酶促转化成异丁烯。3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯是脱羧反应。脱羧是移除羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。已经在US-A1-2009/0092975中提出3-甲基巴豆酸脱羧，但是不存在这种转化的实验证据。在US-A1-2009/0092975中，描述了衍生自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的称作PAD1的核酸序列并且公开其编码脱羧酶。提出这种酶可用作重组生物中的选择标记，同时描述可以使用“弱酸”作为选择剂。在许多其他弱酸当中，提到3-甲基巴豆酸作为潜在的“弱酸”。但是，仅后来才发现，现实中上述PAD1不提供脱羧酶活性。实际上，细菌ubiD和ubiX或同源性真核fdc1和pad1基因已经涉及非氧化性可逆脱羧。认定苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)和阿魏酸脱羧酶(FDC)的联合作用是酿酒酵母中苯基丙烯酸脱羧必需的(J.Biosci.Bioeng.109,(2010),564-569；AMBExpress,5:12(2015)1-5；ACSChem.Biol.10(2015),1137-1144)。最近，将上述作为苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)描述的酶家族表征作为FMN异戊烯基转移酶并且不再表征为脱羧酶。已经显示Fdc1(但并非PAD)完全负责可逆脱羧酶活性并且它需要新类型的辅因子，即由结合的UbiX(或Pad1)蛋白合成的异戊二烯化黄素(prenylatedflavin)。因此，已经确定这种PAD酶的真实酶活性为用异戊二烯基部分(来自二甲基烯丙基-磷酸或焦磷酸，称作DMAP或DMAPP)转化黄素单核苷酸(FMN)辅因子。因此，与现有技术的观点相反，真实脱羧酶是与修饰的FMN(异戊二烯化-FMN)结合的阿魏酸脱羧酶(FDC)。最近描述了阿魏酸脱羧酶(FDC)与修饰的FMN(异戊二烯化-FMN)(其由PAD酶提供)结合的这种机制，并且该机制包括令人惊讶的酶促机制，即，借助1,3-偶极环化加成的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生异丁烯的方法，包括使3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，/n其中利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生辅因子，/n其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAP：/n(i)使二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)酶促转化成所述DMAP；或/n(ii)其中使异戊烯醇直接酶促转化成所述DMAP的单个酶促步骤；或/n(iii)两个酶促步骤，包括：/n首先使DMAPP酶促成转化异戊烯醇；并且/n随后使如此获得的异戊烯醇酶促转化成所述DMAP；或/n(iv)使异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成所述DMAP，/n或通过(i)至(iv)中任一者的组合；和/或/n其中利用二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAPP：/n(v)使异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成所述DMAPP；或/n(vi)使二甲基烯丙基磷酸(DMAP)酶促转化成所述DMAPP；或/n(vii)使异戊烯醇酶促转化成所述DMAPP；/n(viii)或通过(v)至(vii)中任一者的组合。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170510 EP 17170429.91.一种用于产生异丁烯的方法，包括使3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶，实现3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，
其中利用二甲基烯丙基磷酸(DMAP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生辅因子，
其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAP：
(i)使二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)酶促转化成所述DMAP；或
(ii)其中使异戊烯醇直接酶促转化成所述DMAP的单个酶促步骤；或
(iii)两个酶促步骤，包括：
首先使DMAPP酶促成转化异戊烯醇；并且
随后使如此获得的异戊烯醇酶促转化成所述DMAP；或
(iv)使异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成所述DMAP，
或通过(i)至(iv)中任一者的组合；和/或
其中利用二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，所述FMN异戊烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)的异戊二烯化，其中所述方法还包括通过以下方式酶促提供所述DMAPP：
(v)使异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成所述DMAPP；或
(vi)使二甲基烯丙基磷酸(DMAP)酶促转化成所述DMAPP；或
(vii)使异戊烯醇酶促转化成所述DMAPP；
(viii)或通过(v)至(vii)中任一者的组合。


2.根据权利要求1(i)所述的方法，其中通过利用磷酸酶，实现DMAPP酶促转化成所述DMAP。


3.根据权利要求2所述的方法，其中磷酸酶是
作用于含磷的酐类的酶(EC3.6.1.-)、优选地ADP-核糖焦磷酸酶(EC3.6.1.13)、8-氧代-dGTP二磷酸酶(EC3.6.1.55)、双(5'-核苷基)-四磷酸酶(EC3.6.1.41)、UDP-糖二磷酸酶(EC3.6.1.45)、外切聚磷酸酶(EC3.6.1.11)、鸟苷-5'-三磷酸/3'-二磷酸焦磷酸酶(EC3.6.1.40)、NADH焦磷酸酶(EC3.6.1.22)、核苷酸二磷酸酶(EC3.6.1.9)或酰基磷酸酶(EC3.6.1.7)；或
磷单酯水解酶(EC3.1.3.-)、优选地3'(2'),5'-二磷酸核苷酸酶(EC3.1.3.7)、5-氨基-6-(5-磷-D-核糖醇基氨基)尿嘧啶磷酸酶或果糖-1,6-二磷酸酶(EC3.1.3.11)。


4.根据权利要求1(i)所述的方法，其中通过利用异戊烯基磷酸激酶(EC2.7.4.26)实现DMAPP酶促转化成DMAP。


5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，还包括通过使异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成DMAPP，提供DMAPP。


6.根据权利要求5所述的方法，其中通过利用异构酶、优选地异戊烯基二磷酸DELTA异构酶(EC5.3.3.2)，实现异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成DMAPP。


7.根据权利要求1(ii)所述的方法，其中通过利用激酶，实现异戊烯醇酶促转化成DMAP。


8.根据权利要求7所述的方法，其中激酶是以醇基作为接纳体的的磷酸转移酶(EC2.7.1.-)、优选地羟乙基噻唑激酶(EC2.7.1.50)。


9.根据权利要求1(iii)所述的方法，其中通过利用磷酸酶或焦磷酸酶，实现DMAPP酶促转化成异戊烯醇和/或通过利用激酶，实现如此获得的异戊烯醇酶促转化成所述DMAP。


10.根据权利要求9所述的方法，其中磷酸酶或焦磷酸酶是：
碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)、糖磷酸酶(EC3.1.3.23)、磷脂酰甘油磷酸酶(EC3.1.3.27)、二酰甘油焦磷酸磷酸酶(EC3.1.3.81)、磷脂酸磷酸酶(EC3.1.3.4)、磷酸丝氨酸磷酸酶(EC3.1.3.3)、磷酸乙醇酸磷酸酶(EC3.1.3.18)、嘧啶5'-核苷酸酶(EC3.1.3.5)、磷酸吡哆醛磷酸酶(EC3.1.3.74)或果糖-16-二磷酸酶(EC3.1.3.11)；或
UDP-糖二磷酸酶(EC3.6.1.45)或十一异戊二烯基焦磷酸磷酸酶(EC3.6.1.27)；或
异戊二烯基-二磷酸酶(EC3.1.7.1)；或
异戊烯基磷酸激酶(EC2.7.4.26)；和/或
其中激酶是以醇基作为接纳体的的磷酸转移酶(EC2.7.1.-)、优选地羟乙基噻唑激酶(EC2.7.1.50)。


11.根据权利要求1(iv)所述的方法，其中通过利用异构酶，实现异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成所述DMAP。


12.根据权利要求11所述的方法，其中异构酶是异戊烯基二磷酸DELTA异构酶(EC5.3.3.2)。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，还包括通过使核黄素酶促转化成黄素单核苷酸(FMN)，酶促提供所述黄素辅因子。


14.根据权利要求13所述的方法，其中通过利用以下者，实现核黄素酶促转化成FMN：
激酶，优选地
古细菌核黄素激酶(EC2.7.1.161)，
衍生自酿酒酵母(S.cerevisiae)或衍生自褐家鼠(Rattusnorvegicus)的黄素激酶，衍生自埃氏巨球型菌(Megasphaeraelsdenii)的黄素激酶，
以醇基作为接纳体的磷酸转移酶(EC2.7.1)，优选地赤藓糖醇激酶(2.7.1.27)或甘油激酶(2.7.1.30)，
以磷酸酯基作为接纳体的磷酸转移酶(EC2.7.4)，优选地异戊烯基磷酸激酶(EC2.7.4.26)；或
双官能核黄素激酶/FMN腺苷酰基转移酶(ribF)；或
双官能核黄素激酶/FMN腺苷酰基转移酶(ribF)的变体，所述变体显示超过衍生它的相应双官能核黄素激酶/FMN腺苷酰基转移酶的改进的核黄素转化成FMN活性。


15.根据权利要求14所述的方法，其中显示超过衍生它的相应双官能核黄素激酶/FMN腺苷酰基转移酶的改进的核黄素转化成FMN活性的双官能核黄素激酶/FMN腺苷酰基转移酶(ribF)的所述变体，是这样的变体，其具有如SEQIDNO:34中所示的氨基酸序列或具有与SEQIDNO:34具有至少30％序列同一性的氨基酸序列，其中将选自SEQIDNO:34中所示氨基酸序列的位置29和32位置处或与这些位置中任何位置相对应的位置处的一个或多个氨基酸残基置换为另一个氨基酸残基或缺失，或其中已经在这些位置的一个或多个位置实现插入。


16.根据权利要求15所述的方法，其中：
(1)将SEQIDNO:34中所示氨基酸序列的位置29处或与这个位置相对应的位置处的氨基酸残基缺失或置换为丙氨酸；和/或
(2)将SEQIDNO:34中所示氨基酸序列的位置32处或与这个位置相对应的位置处的氨基酸残基缺失或置换丝氨酸或丙氨酸。


17.根据权利要求1(v)所述的方法，其中通过利用异构酶、优选地异戊烯基二磷酸DELTA异构酶(EC5.3.3.2)，实现异戊烯基焦磷酸(IPP)酶促转化成所述DMAPP。


18.根据权利要求1(vi)所述的方法，其中通过利用激酶，优选地异戊烯基单磷酸激酶(EC2.7.4.26)，实现二甲基烯丙基磷酸(DMAP)酶促转化成所述DMAPP。


19.根据权利要求18所述的方法，还包括通过使异戊烯醇酶促转化成DMAP或通过使异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成DMAP，提供DMAP。


20.根据权利要求19所述的方法，其中通过利用激酶，优选地以醇基作为接纳体的磷酸转移酶(EC2.7.1.-)、更优选地羟乙基噻唑激酶(EC2.7.1.50)，实现异戊烯醇酶促转化成所述DMAP。


21.根据权利要求19所述的方法，其中通过利用异构酶、优选地异戊烯基二磷酸DELTA异构酶(EC5.3.3.2)，实现异戊烯基单磷酸(IMP)酶促转化成DMAP。


22.根据权利要求1(vii)所述的方法，其中通过利用二磷酸转移酶(EC2.7.6.-)、优选地硫胺素二磷酸激酶(EC2.7.6.2)或2-氨基-4-羟-6-羟甲基二氢蝶啶二磷酸激酶(EC2.7.6.3)，实现异戊烯醇酶促转化成DMAPP。


23.重组生物或微生物，其重组地表达与FMN异戊烯基转移酶结合的FMN依赖性脱羧酶；其中所述重组生物或微生物还重组地表达以下(i)至(iv)中至少一者：
(i)催化二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)酶促转化成二甲基烯丙基磷酸(DMAP)的酶，其中所述酶是磷酸酶，
优选地，作用于含磷的酐类的酶(EC3.6.1.-)，更优选地，ADP-核糖焦磷酸酶(EC3.6.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·夏约，M·阿拉尔，M·阿尼斯莫瓦，
申请(专利权)人：环球生物能源公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR