具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途制造技术

本公开提供衍生自苏云金芽孢杆菌菌株的核酸及其变体和片段，所述核酸及其变体和片段编码变体多肽，所述变体多肽针对包括鳞翅目和鞘翅目的昆虫有害生物具有增加的杀有害生物活性。本公开的具体实施例提供编码杀有害生物蛋白的分离的核酸、杀有害生物组合物、DNA构建体、以及包含实施例的核酸的经转化的微生物和植物。这些组合物可应用于防治有害生物，特别是植物有害生物的方法中。

Insecticidal peptides with improved active spectrum and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途以电子方式提交的序列表的引用文件名为“7443PSP_SequenceListing.txt”的序列表创建于2017年5月19日，并且大小为801千字节，以计算机可读形式，同时与本说明书一起提交。序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
本公开涉及编码杀有害生物多肽的重组核酸，所述杀有害生物多肽具有针对玉米穗蛾(comearworm)和/或秋黏虫(fallarmyworm)的杀昆虫活性和/或针对昆虫有害生物的改善的杀有害生物活性谱。本公开的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的杀有害生物多肽来控制植物有害生物。
技术介绍
昆虫有害生物是全世界农作物损失中的一个主要因素。例如，黏虫摄食、黑切根虫损害或欧洲玉米螟损害对农业生产者来说在经济上可能是破坏性的。仅欧洲玉米螟对田间和甜玉米的攻击造成的昆虫有害生物相关的作物损失就已经达到每年约十亿美元的损失和控制费用。传统上，影响昆虫有害生物群体的主要方法是应用广谱化学杀昆虫剂。然而，消费者和政府监管者同样地越来越关注与化学合成杀有害生物剂的生产和使用相关的环境危害。由于这样的关注，监管者已经禁止或限制了更危险的杀有害生物剂中一些的使用。因此，人们对开发替代性杀有害生物剂有很大的兴趣。使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对农业意义上的昆虫有害生物进行生物控制，为化学合成杀有害生物剂提供了环境友好且商业上有吸引力的替代品。一般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强的靶特异性。另外，生物杀有害生物剂往往生产成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。已知芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物的某些物种针对广泛的昆虫有害生物(包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等)具有杀有害生物活性。苏云金芽孢杆菌(Bt)和弧丽金龟芽孢杆菌(Bacilluspapilliae)是迄今发现的最成功的生物控制剂。昆虫致病性也已归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)(Harwook编辑，((1989)Bacillus[芽孢杆菌属](普林汉诺出版公司(PlenumPress))，306)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)(WO96/10083)的菌株。尽管杀有害生物蛋白也已经从芽孢杆菌属的营养生长阶段中分离出来，但是杀有害生物活性似乎集中在伴孢晶体蛋白包含体中。已经分离和表征了编码这些杀有害生物蛋白的若干种基因(参见例如美国专利号5,366,892和5,840,868)。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，作为有害生物化学防治的替代品在农业上起着重要作用。最近，通过对作物植物进行基因工程化以产生来自芽孢杆菌属的杀有害生物蛋白，农业科学家已经开发了具有增强的昆虫抗性的作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以产生从Bt株分离的杀有害生物蛋白(参见例如Aronson(2002)CellMol.LifeSci.[细胞与分子生命科学]59(3)：417-425；Schnepf等人，(1998)MicrobiolMolBiolRev.[微生物学与分子生物学评论]62(3)：775-806)。这些基因工程化的作物现在广泛应用于美国农业，并且为农民提供了传统昆虫防制方法的环境友好的替代品。另外，经过基因工程化以包含杀有害生物的Cry毒素的马铃薯已经向美国农民出售。虽然它们已被证明在商业上非常成功，但是这些遗传工程化抗昆虫作物植物仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提供抗性。因此，仍然需要具有改善的针对昆虫有害生物的杀昆虫活性谱的新的Bt毒素，例如针对来自鳞翅目和/或鞘翅目的昆虫有改善的活性的毒素。另外，仍然需要针对各种昆虫有害生物具有活性的生物杀有害生物剂以及具有改善的杀昆虫活性的生物杀有害生物剂。
技术实现思路
提供了用于影响昆虫有害生物的组合物和方法。更具体地，本公开的实施例涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列以产生经转化的微生物和表达这些实施例的杀昆虫多肽的植物来影响昆虫的方法。在一些实施例中，这些核苷酸序列编码如下多肽，所述多肽为属于鳞翅目的至少一种昆虫的杀有害生物剂。在一些方面，提供了核酸分子及其片段和变体，其编码针对昆虫有害生物具有杀有害生物活性的多肽(例如SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10、SEQIDNO：12、SEQIDNO：14、SEQIDNO：16、SEQIDNO：18、SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26、SEQIDNO：28、SEQIDNO：30、SEQIDNO：32、SEQIDNO：34、SEQIDNO：36、SEQIDNO：38、SEQIDNO：40、SEQIDNO：42、SEQIDNO：44、和SEQIDNO：46，并且分别编码多肽SEQIDNO：3、SEQIDNO：5、SEQIDNO：7、SEQIDNO：9、SEQIDNO：11、SEQIDNO：13、SEQIDNO：15、SEQIDNO：17、SEQIDNO：19、SEQIDNO：21、SEQIDNO：23、SEQIDNO：25、SEQIDNO：27、SEQIDNO：29、SEQIDNO：31、SEQIDNO：33、SEQIDNO：35、SEQIDNO：37、SEQIDNO：39、SEQIDNO：41、SEQIDNO：43或SEQIDNO：45)。这些实施例进一步提供编码生物活性的(例如杀昆虫的)多肽的所公开的核苷酸序列的片段和变体。在另一个方面，提供了变体Cry1B多肽，所述变体Cry1B多肽由实施例的经修饰(例如，经诱变或操作的)核酸分子编码。在具体实例中，实施例的杀有害生物蛋白包括由设计用于将特定氨基酸序列引入实施例的多肽的诱变核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段。在具体实施例中，相对于自其衍生的天然存在的多肽的活性，多肽具有增强的杀有害生物活性。在另一方面提供嵌合Cry1B多肽。在另一个方面，实施例的核酸还可以用于产生特征在于基因组的转基因(例如，经转化的)单子叶植物或双子叶植物，所述基因组包含含有实施例的编码序列的至少一种稳定掺入的核苷酸构建体，所述编码序列可操作地连接到驱动编码的杀有害生物多肽的表达的启动子。因此，也提供了经转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。在另一个方面，经转化的植物可以使用已经被优化以在宿主植物中增加表达的核酸来产生。例如，可以将实施例的杀有害生物多肽之一进行反向翻译以产生如下核酸，所述核酸包含针对在特定宿主例如作物植物像玉米(corn，Zeamays)植物中表达而优化的密码子。通过这样的经转化的植物(例如双子叶植物或单子叶植物)的编码序列的表达将导致杀有害生物多肽的产生并赋予植物增加的昆虫抗性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含编码一种Cry1B变体多肽的多核苷酸和编码不同的第二Cry1B变体多肽的第二多核苷酸，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述第二Cry1B变体多肽，其中所述第一和第二Cry1B变体多肽各自具有杀昆虫活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170526 US 62/5113851.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含编码一种Cry1B变体多肽的多核苷酸和编码不同的第二Cry1B变体多肽的第二多核苷酸，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述第二Cry1B变体多肽，其中所述第一和第二Cry1B变体多肽各自具有杀昆虫活性。


2.如权利要求1所述的DNA构建体，其中编码所述第一和第二Cry1B变体多肽的多核苷酸各自可操作地连接到异源调节元件。


3.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述不同的第二Cry1B变体多肽各自包含与如在IP1B-B21(SEQIDNO：5)、IP1B-B22(SEQIDNO：7)、IP1B-B23(SEQIDNO：9)、IP1B-B24(SEQIDNO：11)、IP1B-B25(SEQIDNO：13)、IP1B-B26(SEQIDNO：15)、IP1B-B27(SEQIDNO：17)、IP1B-B28(SEQIDNO：19)、IP1B-B29(SEQIDNO：21)、IP1B-B40(SEQIDNO：31)、IP1B-B41(SEQIDNO：33)、IP1B-B42(SEQIDNO：35)、IP1B-B43(SEQIDNO：37)、IP1B-B44(SEQIDNO：39)、IP1B-B45(SEQIDNO：41)、IP1B-B46(SEQIDNO：43)、IP1B-B47(SEQIDNO：45)、IP1B-B60(SEQIDNO：62)、IP1B-B61(SEQIDNO：63)、IP1B-B62(SEQIDNO：64)、IP1B-B63(SEQIDNO：65)、IP1B-B64(SEQIDNO：66)、IP1B-B65(SEQIDNO：67)、IP1B-B66(SEQIDNO：68)、IP1B-B67(SEQIDNO：69)、IP1B-B68(SEQIDNO：70)、IP1B-B69(SEQIDNO：71)、IP1B-B80(SEQIDNO：72)、IP1B-B81(SEQIDNO：73)、IP1B-B82(SEQIDNO：74)、IP1B-B83(SEQIDNO：75)、IP1B-B100(SEQIDNO：76)、和IP1B-B101(SEQIDNO：77)、IP1B-B102(SEQIDNO：78)、SL8-01(SEQIDNO：143)、SL8-02(SEQIDNO：144)、IP1B-B31(SEQIDNO：23)、IP1B-B32(SEQIDNO：25)、IP1B-B33(SEQIDNO：27)和IP1B-B34(SEQIDNO：29)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。


4.如权利要求1所述的DNA构建体，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述不同的第二Cry1B变体多肽各自具有不同的作用位点、作用方式，或第二Cry1B变体多肽对于对所述第一Cry1B变体多肽的活性有抗性的昆虫具有活性。


5.如权利要求1所述的DNA构建体，其中第一Cry1B变体多肽包含与如在SEQIP1B-B21(SEQIDNO：5)、IP1B-B22(SEQIDNO：7)、IP1B-B23(SEQIDNO：9)、IP1B-B24(SEQIDNO：11)、IP1B-B25(SEQIDNO：13)、IP1B-B26(SEQIDNO：15)、IP1B-B27(SEQIDNO：17)、IP1B-B28(SEQIDNO：19)、IP1B-B29(SEQIDNO：21)、IP1B-B40(SEQIDNO：31)、IP1B-B41(SEQIDNO：33)、IP1B-B42(SEQIDNO：35)、IP1B-B43(SEQIDNO：37)、IP1B-B44(SEQIDNO：39)、IP1B-B45(SEQIDNO：41)、IP1B-B46(SEQIDNO：43)、IP1B-B47(SEQIDNO：45)、IP1B-B60(SEQIDNO：62)、IP1B-B61(SEQIDNO：63)、IP1B-B62(SEQIDNO：64)、IP1B-B63(SEQIDNO：65)、IP1B-B64(SEQIDNO：66)、IP1B-B65(SEQIDNO：67)、IP1B-B66(SEQIDNO：68)、IP1B-B67(SEQIDNO：69)、IP1B-B68(SEQIDNO：70)、IP1B-B69(SEQIDNO：71)、IP1B-B80(SEQIDNO：72)、IP1B-B81(SEQIDNO：73)、IP1B-B82(SEQIDNO：74)、IP1B-B83(SEQIDNO：75)、IP1B-B100(SEQIDNO：76)、和IP1B-B101(SEQIDNO：77)、和IP1B-B102(SEQIDNO：78)、SL8-01(SEQIDNO：143)和SL8-02(SEQIDNO：144)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列，并且其中所述第二Cry1B变体多肽包含与如在IP1B-B31(SEQIDNO：23)、IP1B-B32(SEQIDNO：25)、IP1B-B33(SEQIDNO：27)和IP1B-B34(SEQIDNO：29)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。


6.如权利要求1所述的DNA构建体，其中第一Cry1B变体多肽包含与如在IP1B-B60(SEQIDNO：62)、IP1B-B61(SEQIDNO：63)、IP1B-B62(SEQIDNO：64)、IP1B-B63(SEQIDNO：65)、IP1B-B64(SEQIDNO：66)、IP1B-B65(SEQIDNO：67)、和IP1B-B66(SEQIDNO：68)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列，并且其中所述第二Cry1B变体多肽包含与如在IP1B-B100(SEQIDNO：76)、和IP1B-B101(SEQIDNO：77)、IP1B-B102(SEQIDNO：78)、SL8-01(SEQIDNO：143)和SL8-02(SEQIDNO：144)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。


7.一种包含分子堆叠物的转基因植物，所述分子堆叠物包含编码一种Cry1B变体多肽的多核苷酸和编码不同的第二Cry1B变体多肽的第二多核苷酸，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述第二Cry1B变体多肽，其中所述第一和第二Cry1B变体多肽各自具有杀昆虫活性。


8.如权利要求7所述的转基因植物，其中编码所述第一和第二Cry1B变体多肽的多核苷酸各自可操作地连接到异源调节元件。


9.如权利要求7所述的转基因植物，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述不同的第二Cry1B变体多肽各自包含与如在IP1B-B21(SEQIDNO：5)、IP1B-B22(SEQIDNO：7)、IP1B-B23(SEQIDNO：9)、IP1B-B24(SEQIDNO：11)、IP1B-B25(SEQIDNO：13)、IP1B-B26(SEQIDNO：15)、IP1B-B27(SEQIDNO：17)、IP1B-B28(SEQIDNO：19)、IP1B-B29(SEQIDNO：21)、IP1B-B40(SEQIDNO：31)、IP1B-B41(SEQIDNO：33)、IP1B-B42(SEQIDNO：35)、IP1B-B43(SEQIDNO：37)、IP1B-B44(SEQIDNO：39)、IP1B-B45(SEQIDNO：41)、IP1B-B46(SEQIDNO：43)、IP1B-B47(SEQIDNO：45)、IP1B-B60(SEQIDNO：62)、IP1B-B61(SEQIDNO：63)、IP1B-B62(SEQIDNO：64)、IP1B-B63(SEQIDNO：65)、IP1B-B64(SEQIDNO：66)、IP1B-B65(SEQIDNO：67)、IP1B-B66(SEQIDNO：68)、IP1B-B67(SEQIDNO：69)、IPlB-B68(SEQIDNO：70)、IP1B-B69(SEQIDNO：71)、IP1B-B80(SEQIDNO：72)、IP1B-B81(SEQIDNO：73)、IP1B-B82(SEQIDNO：74)、IP1B-B83(SEQIDNO：75)、IP1B-B100(SEQIDNO：76)、和IPlB-B101(SEQIDNO：77)、IP1B-B102(SEQIDNO：78)、SL8-01(SEQIDNO：143)、SL8-02(SEQIDNO：144)、IP1B-B31(SEQIDNO：23)、IP1B-B32(SEQIDNO：25)、IP1B-B33(SEQIDNO：27)和IP1B-B34(SEQIDNO：29)中所示的序列之一具有至少95％同一性的序列。


10.如权利要求7所述的转基因植物，其中所述第一Cry1B变体多肽和所述不同的第二Cry1B变体多肽各自具有不同的作用位点、作用方式，或第二Cry1B变体多肽对于对所述第一Cry1B变体多肽的活性有抗性的昆虫具有活性。


11.如权利要求7所述的转基因植物，其中第一Cry1B变体多肽包含与如在SEQIP1B-B21(SEQIDNO：5)、IP1B-B22(SEQIDNO：7)、IP1B-B23(SEQIDNO：9)、IP1B-B24(SEQIDNO：11)、IP1B-B25(SEQIDNO：13)、IP1B-B26(SEQIDNO：15)、IP1B-B27(SEQIDNO：17)、IP1B-B28(SEQIDNO：19)...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL卢，ME尼尔森，G吴，T亚马莫托，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US