胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器制造技术

本公开的一些方面提供了可用于核酸的靶向编辑，包括编辑细胞或受试者的基因组内，例如人类基因组内的单个位点的组合物、策略、系统、试剂、方法和试剂盒。在一些实施方案中，提供了能够在核酸(例如，基因组DNA)中诱导胞嘧啶(C)改变为鸟嘌呤(G)的融合蛋白。在一些实施方案中，提供了核酸可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9)，和核酸编辑蛋白或蛋白质域，例如脱氨酶域，聚合酶域和/或碱基切除酶的融合蛋白。在一些实施方案中，提供了用于靶向核酸编辑的方法。在一些实施方案中，提供了用于产生靶向核酸编辑蛋白，例如核酸可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9)，和核酸编辑蛋白或域的融合蛋白的试剂和试剂盒。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器专利技术背景核酸序列的靶向编辑，例如对基因组DNA的靶向切割或特定修饰的靶向引入，是用于研究基因功能的高度有前景的方法，并且还具有为人类遗传疾病提供新疗法的潜力。由于许多遗传疾病原则上可以通过影响基因组中的特定位置处特定的核苷酸变化(例如，与疾病相关的基因的特定密码子中的C至G或G至C的变化)来治疗，实现此类精确的基因编辑的可编程方式的开发既代表强大的新研究工具，又代表基于基因编辑的治疗学的潜在新方法。专利技术概述本文中提供修饰多核苷酸(例如，DNA)，例如在多核苷酸中产生胞嘧啶至鸟嘌呤突变的组合物、试剂盒和方法。如本文中更详细描述的，碱基编辑(例如，C至G编辑)通过除去核碱基(例如，胞嘧啶(C))，从而在核酸序列内产生无碱基位点来完成。然后，例如通过内源性跨损伤聚合酶将与无碱基位点相对的核碱基(例如鸟嘌呤)替换为不同的核碱基(例如胞嘧啶)。本文所述的碱基编辑融合蛋白能够在核酸(例如基因组DNA)内产生特定突变(例如C至G突变)，其可用于例如治疗涉及核酸突变，例如C至G或G至C突变的疾病。C至G碱基编辑器的一个实例包括融合蛋白，其含有核酸可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9域)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)域和胞苷脱氨酶。不希望受任何特定理论的束缚，此类碱基编辑融合蛋白能够与特定核酸序列结合(例如，通过Cas9域)，使核酸序列内的胞嘧啶脱氨基为尿苷，然后尿苷可以通过UDG从核酸分子中切除。然后可以例如通过内源性跨损伤聚合酶将与无碱基位点相对的核碱基替换为另一种碱基(例如胞嘧啶)。通常，碱基修复机制(例如，在细胞中)用胞嘧啶替换无碱基位点相对的核碱基，尽管其他碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶)可以替换与无碱基位点相对的核碱基。此外，发现将跨损伤聚合酶掺入碱基编辑器中可以增加与无碱基位点相对的胞嘧啶掺入。因此，对碱基编辑器进行工程化改造，以掺入各种跨损伤聚合酶，以提高碱基编辑效率。增加与无碱基位点相对的C整合的偏好的跨损伤聚合酶可以改善C至G核碱基编辑。应当理解，优先整合非C核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)的其他跨损伤聚合酶可以用于产生备选突变(例如C至A突变)。作为另一个例子，碱基编辑融合蛋白可以包括核酸可编程DNA结合蛋白(例如，Cas9域)和除去核碱基(例如，胞嘧啶)的碱基切除酶(baseexcisionenzyme)。如上所述，不是将胞嘧啶脱氨基成尿苷并使用UDG将尿苷切除，碱基编辑器可以包括碱基切除酶，该碱基切除酶识别并除去核碱基诸如胞嘧啶或胸腺嘧啶，而无需首先对其进行脱氨基。因此，已经通过将核酸可编程DNA结合蛋白(例如Cas9域)融合到从核酸分子中除去胞嘧啶或胸腺嘧啶的碱基切除酶来工程化改造碱基编辑器(例如，C至G碱基编辑器)。此外，与上文描述的碱基编辑器一样，将跨损伤聚合酶掺入该碱基编辑器中以增加与通过碱基编辑器的碱基切除酶产生的无碱基位点相对的胞嘧啶掺入。例如，在图1-6、33-36、40和52中可以看到示例性的碱基编辑蛋白和概述碱基编辑策略的示意图。在一些实施方案中，本公开内容提供了能够进行碱基编辑的融合蛋白。示例性的碱基编辑融合蛋白包括以下各项。在一些实施方案中，融合蛋白包括(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，(ii)胞苷脱氨酶域和(iii)尿嘧啶结合蛋白(UBP)。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含(iv)核酸聚合酶域(NAP)。作为另一个例子，融合蛋白可包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，(ii)胞苷脱氨酶域和(iii)核酸聚合酶(NAP)域。作为另一个例子，融合蛋白可包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，和(ii)碱基切除酶(BEE)。在一些实施方案中，融合蛋白还包括(iii)核酸聚合酶(NAP)域。在下面进一步详细描述碱基编辑器和使用碱基编辑器的方法。附图简述图1显示了一般示意图，其显示了C至T和C至G碱基编辑。已知某些DNA聚合酶(例如，跨损伤聚合酶)用G替换无碱基位点相对的碱基。实现C至G碱基编辑的一种策略是诱导无碱基位点的创建，然后募集或拴系此类聚合酶来用C替换替换无碱基位点的G。图2显示了一般示意图，其显示了通过无碱基位点生成的碱基编辑和用于C至G编辑的碱基特异性修复。图3显示了显示来自图1的方案1的示意图，其中形成无碱基位点，用于C至G碱基编辑。若有效生成无碱基，则这可以增加经由C至G编辑途径的总通量。图4显示了显示用于C至G碱基编辑的方法1的示意图，其中使用无碱基位点形成的增加。若通过例如使用UDG域和跨损伤聚合酶有效地产生无碱基，则这可以增加经由C至G编辑途径的总通量。图5显示了显示UdgX对碱基编辑的影响的示意图。UdgX(一种经鉴定与具有最小尿嘧啶切割活性的尿嘧啶紧密结合的UDG直向同源物)增加C至G编辑的量。在1.)中，UdgX*是通过体外测定法确定缺乏尿嘧啶结合活性的UDG变体。在2.)中，UdgX_On是通过体外测定法显示增加尿嘧啶切割的变体。在3.)中，UDG指导融合物切割尿嘧啶。图6显示了示意图(左图)，其显示了示例性的C至T碱基编辑器(例如，BE3)，其包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)、Cas9域(例如，nCas9)和胞苷脱氨酶。右边是显示C至G碱基编辑器的示意图，所述C至G碱基编辑器包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)(或其变体)、Cas9域(例如nCas9)和胞苷脱氨酶。图7显示了使用七种碱基编辑器(BE3；BE3_UdgX；BE3_UdgX*；BE2_UdgX_On；BE3_UdgX_On；BE2_UDG；和BE3_UDG)在WTHap1细胞中HEK2位点处的总编辑百分比。原始编辑值显示在左图中。右图显示了对与含有经编辑的C的链相对的DNA链进行测序时原始编辑值的图示，其中C至G碱基编辑通过点柱形(G)移至实心柱形(C)以图形显示。图8显示了在WTHap1细胞中用其它C至G碱基编辑器(BE3；BE3_UdgX；BE3_REV7；和SMUG1，其中从图4重复BE3和BE3_UdgX)在HEK2位点处的总编辑百分比。顶部图显示原始编辑值。底部图显示了对与含有经编辑的C的链相对的DNA链进行测序时原始编辑值的图示，其中C至G的碱基编辑通过点柱形(G)移至实心柱形(C)以图形显示。图9显示了WTHap1细胞中用各种C至G碱基编辑器(BE3；BE3_UdgX；BE3_UdgX*；BE3_REV7；BE2_UDG；BE3_UDGBE2_UdgX_On；BE3_UdgX_On；和SMUG1)在HEK2位点处的编辑特异性比。顶部图显示了编辑物的总百分比以及已经从G至A、C或T产生的编辑物的比率。底部图是特异性比率值的图示。图10显示了使用七种碱基编辑器(BE3；BE3_UdgX；BE3_UdgX*；BE2_UdgX_On；BE3_UdgX_On；BE2_UDG；和BE3_UDG)在WTHap1细胞中RNF2位点处的总编辑百分比。原始编辑值显示在左图中。右边的图显示了对与含有经编辑的C的链相对的DNA链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，和(ii)胞苷脱氨酶域，以及(iii)尿嘧啶结合蛋白(UBP)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170310 US 62/470,1751.融合蛋白，其包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，和(ii)胞苷脱氨酶域，以及(iii)尿嘧啶结合蛋白(UBP)。


2.权利要求1的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是尿嘧啶修饰酶。


3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是尿嘧啶碱基切除酶(baseexcisionenzyme)。


4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。


5.权利要求4的融合蛋白，其中所述尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)来自人、小鼠、大鼠、犬、猴、牛、猕猴、黑猩猩、大猩猩、海八目鳗(sealamprey)，或其具有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的任何变体。


6.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是UdgX，其包含与SEQIDNO:49(UdgX)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


7.权利要求6的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白包含SEQIDNO:49(UdgX)的氨基酸序列。


8.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是UDG，其包含与SEQIDNO:48(UDG)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


9.权利要求8的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白包含SEQIDNO:48(UDG)的氨基酸序列。


10.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是UdgX*，其包含与SEQIDNO:50(UdgX*)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


11.权利要求10的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白包含SEQIDNO:50(UdgX*)的氨基酸序列。


12.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是UdgX_On，其包含与SEQIDNO:51(UdgX_On)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


13.权利要求12的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白包含SEQIDNO:51(UdgX_On)的氨基酸序列。


14.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述尿嘧啶结合蛋白是SMUG1，其包含与SEQIDNO:53(SMUG1)的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


15.权利要求14的融合蛋白，其中尿嘧啶结合蛋白包含SEQIDNO:53(SMUG1)的氨基酸序列。


16.权利要求1-15中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
[胞苷脱氨酶]-[napDNAbp]-[UBP]，其中“]-[”的每个情况包含任选的接头。


17.权利要求1-16中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶和所述napDNAbp是经由接头融合的。


18.权利要求17的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶和所述napDNAbp是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


19.权利要求1至18中任一项的融合蛋白，其中所述napDNAbp和所述UBP是经由接头融合的。


20.权利要求19的融合蛋白，其中所述napDNAbp和所述UBP是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


21.权利要求1-20中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含(iv)核酸聚合酶域(NAP)。


22.权利要求21的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是真核核酸聚合酶域。


23.权利要求21或22的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是DNA聚合酶域。


24.权利要求21至23中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域具有跨损伤聚合酶活性。


25.权利要求21至24中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是跨损伤DNA聚合酶。


26.权利要求21-25中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域来自Rev7、Rev1复合物、聚合酶iota、聚合酶kappa和聚合酶eta。


27.权利要求21至25中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域选自真核聚合酶的组，该组由alpha、beta、gamma、delta、epsilon、gamma、eta、iota、kappa、lambda、mu、和nu组成。


28.权利要求21至27中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含与SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


29.权利要求21-28中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列。


30.权利要求21-29中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
[胞苷脱氨酶]-[napDNAbp]-[UBP]-[NAP]；
[胞苷脱氨酶]-[napDNAbp]-[NAP]-[UBP]；
[胞苷脱氨酶]-[NAP]-[napDNAbp]-[UBP]；或
[NAP]-[胞苷脱氨酶]-[napDNAbp]-[UBP]；
其中“]-[”的每个情况包括任选的接头。


31.权利要求21至30中任一项的融合蛋白，其中所述NAP和所述UBP是经由接头融合的。


32.权利要求31的融合蛋白，其中所述NAP和所述UBP是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


33.权利要求21-32中任一项的融合蛋白，其中所述NAP和所述napDNAbp是经由接头融合的。


34.权利要求33的融合蛋白，其中所述NAP和所述napDNAbp是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


35.权利要求21-34中任一项的融合蛋白，其中所述NAP和所述胞苷脱氨酶是经由接头融合的。


36.权利要求35的融合蛋白，其中所述NAP和胞苷脱氨酶是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


37.权利要求1-36中任一项的融合蛋白，其中所述napDNAbp包含Cas9域。


38.权利要求37的融合蛋白，其中所述Cas9域包含与SEQIDNO:4-26中任一项至少85％相同的氨基酸序列。


39.权利要求37或38的融合蛋白，其中所述Cas9域包含SEQIDNO:4-26中任一项的氨基酸序列。


40.权利要求37的融合蛋白，其中所述Cas9域是Cas9切口酶(nCas9)。


41.权利要求40的融合蛋白，其中所述Cas9切口酶(nCas9)包含与SEQIDNO:10、13、16或21中任一项至少85％相同的氨基酸序列。


42.权利要求40或41的融合蛋白，其中所述nCas9包含SEQIDNO:10、13、16或21中任一项的氨基酸序列。


43.权利要求37的融合蛋白，其中所述Cas9域是无核酸酶活性的Cas9(dCas9)。


44.权利要求43的融合蛋白，其中所述无核酸酶活性的Cas9(dCas9)包含与SEQIDNO:7、8、9或22中的任一项至少85％相同的氨基酸序列。


45.权利要求43或44的融合蛋白，其中所述dCas9包含SEQIDNO:7、8、9或22中任一项的氨基酸序列。


46.融合蛋白，其包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，和(ii)胞苷脱氨酶域，以及(iii)核酸聚合酶(NAP)域。


47.权利要求46的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是真核核酸聚合酶域。


48.权利要求46或47的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是DNA聚合酶域。


49.权利要求46-48中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域具有跨损伤聚合酶活性。


50.权利要求46-49中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是跨损伤DNA聚合酶。


51.权利要求46至50中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域来自Rev7、Rev1复合物、聚合酶iota、聚合酶kappa和聚合酶eta。


52.权利要求46-51中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域选自真核聚合酶的组，该组由alpha、beta、gamma、delta、epsilon、gamma、eta、iota、kappa、lambda、mu、和nu组成。


53.权利要求46-52中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含与SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


54.权利要求46-53中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列。


55.权利要求1-54中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是来自载脂蛋白BmRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶的脱氨酶。


56.权利要求55的融合蛋白，其中所述APOBEC家族脱氨酶选自下组：APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、和APOBEC3H脱氨酶。


57.权利要求1-56中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域包含与SEQIDNO:67-101中任一项的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列。


58.权利要求1-57中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域包含SEQIDNO:67-101中任一项的氨基酸序列。


59.权利要求1-57中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是大鼠APOBEC1(rAPOBEC1)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:93的W90Y，R126E和R132E，或另一个APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。


60.权利要求1-57中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是人APOBEC1(hAPOBEC1)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:91的W90Y，Q126E和R132E，或另一个APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。


61.权利要求1-57中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是人APOBEC3G(hAPOBEC3G)脱氨酶，其包含一个或多个选自下组的突变：SEQIDNO:77的W285Y,R320E和R326E，或另一个APOBEC脱氨酶中的一个或多个相应突变。


62.权利要求1-54中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是激活诱导的脱氨酶(AID)。


63.权利要求1-54中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶域是来自海七鳃鳗(Petromyzonmarinus)的胞苷脱氨酶1(pmCDA1)。


64.权利要求46-63中任一项的融合蛋白，其中所述napDNAbp包含Cas9域。


65.权利要求64的融合蛋白，其中所述Cas9域包含与SEQIDNO:4-26中任一项至少85％相同的氨基酸序列。


66.权利要求64或65的融合蛋白，其中所述Cas9域包含SEQIDNO:4-26中任一项的氨基酸序列。


67.权利要求64的融合蛋白，其中所述Cas9域是Cas9切口酶(nCas9)。


68.权利要求67的融合蛋白，其中所述Cas9切口酶(nCas9)包含与SEQIDNO:10、13、16或21至少85％相同的氨基酸序列。


69.权利要求67或68的融合蛋白，其中所述nCas9包含SEQIDNO:10、13、16或21的氨基酸序列。


70.权利要求64的融合蛋白，其中所述Cas9域是无核酸酶活性的Cas9(dCas9)。


71.权利要求70的融合蛋白，其中所述无核酸酶活性的Cas9(dCas9)包含与SEQIDNO:7、8、9或22至少85％相同的氨基酸序列。


72.权利要求70或71的融合蛋白，其中所述无核酸酶活性的Cas9(dCas9)包含SEQIDNO:7、8、9或22的氨基酸序列。


73.权利要求46-72中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
[胞苷脱氨酶]-[napDNAbp]-[NAP]，其中“]-[”的每个情况包含任选的接头。


74.权利要求46-73中任一项的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶和所述napDNAbp是经由接头融合的。


75.权利要求74的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶和所述napDNAbp是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


76.权利要求46-75中任一项的融合蛋白，其中所述napDNAbp和所述NAP是经由接头融合的。


77.权利要求76的融合蛋白，其中所述napDNAbp和所述NAP是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


78.融合蛋白，其包含(i)核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)，和(ii)碱基切除酶(BEE)。


79.权利要求78的融合蛋白，其中所述碱基切除酶是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)碱基切除酶。


80.权利要求78或79的融合蛋白，其中所述碱基切除酶是胞嘧啶(C)碱基切除酶。


81.权利要求79或80的融合蛋白，其中所述碱基切除酶包含与SEQIDNO:48至少85％相同的氨基酸序列，并且在SEQIDNO:48的氨基酸残基156处包含A。


82.权利要求80或81的融合蛋白，其中所述碱基切除酶包含SEQIDNO:65的氨基酸序列。


83.权利要求78或79的融合蛋白，其中所述碱基切除酶是胸腺嘧啶(T)碱基切除酶。


84.权利要求83的融合蛋白，其中所述碱基切除酶包含与SEQIDNO:48至少85％相同的氨基酸序列，并且在SEQIDNO:48的氨基酸残基213处包含D。


85.权利要求B6或B7的融合蛋白，其中所述碱基切除酶包含SEQIDNO:66的氨基酸序列。


86.权利要求78-85中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
[napDNAbp]-[BEE]或[BEE]-[napDNAbp]，其中“]-[”的每个情况包含任选的接头。


87.权利要求78-86中任一项的融合蛋白，其中所述BEE和napDNAbp是经由接头融合的。


88.权利要求86或87的融合蛋白，其中所述BEE和所述napDNAbp是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


89.权利要求78-88中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包含(iii)核酸聚合酶(NAP)域。


90.权利要求89的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是真核核酸聚合酶域。


91.权利要求89或90的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是DNA聚合酶域。


92.权利要求89-91中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域具有跨损伤聚合酶活性。


93.权利要求89-92中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域是跨损伤DNA聚合酶。


94.权利要求89-93中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域来自Rev7、Rev1复合物、聚合酶iota、聚合酶kappa和聚合酶eta.。


95.权利要求89-94中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域选自真核聚合酶的组，所述组由alpha、beta、gamma、delta、epsilon、gamma、eta、iota、kappa、lambda、mu、和nu组成。


96.权利要求89-95中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含与SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。


97.权利要求89-96中任一项的融合蛋白，其中所述核酸聚合酶域包含SEQIDNO:54-64中任一项的氨基酸序列。


98.权利要求89-97中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下结构：
[napDNAbp]-[BEE]-[NAP]；
[napDNAbp]-[NAP]-[BEE]；
[NAP]-[napDNAbp]-[BEE]；
[NAP]-[BEE]-[napDNAbp]；
[BEE]-[napDNAbp]-[NAP]；或
[BEE]-[NAP]-[napDNAbp]
其中“]-[”的每个情况包括任选的接头。


99.权利要求89-98中任一项的融合蛋白，其中所述NAP和所述BEE是经由接头融合的。


100.权利要求99的融合蛋白，其中所述NAP和所述BEE是经由包含SEQIDNO:102-109中任一项的氨基酸序列的接头融合的。


101.权利要求89-100中任一项的融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，LW科布兰，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国;US