一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，属于代谢工程技术领域，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7‑还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本发明专利技术提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本发明专利技术中，所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇Δ7‑还原酶和葡萄糖脱氢酶，就可以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子，利用甾醇Δ7‑还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇，从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。

An engineering strain of Saccharomyces cerevisiae producing rapeseed sterol and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于代谢工程
，尤其涉及一种产生菜籽甾醇酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
菜籽甾醇(Brassicasterol,CAS号474-67-9)是一种重要的甾体化合物，它可以合成芸苔素内酯等农药，具有很重要的价值。菜籽甾醇主要通过植物提取获得，但由于菜籽甾醇在植物中的含量较低，分离纯化比较困难。化学合成菜籽甾醇已经获得成功，尚没有工业化生产的报道。菜籽甾醇来源稀缺导致了市售的菜籽甾醇价格非常昂贵。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种产生菜籽甾醇酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，本专利技术提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。优选的，所述甾醇Δ7-还原酶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。优选的，所述甾醇Δ7-还原酶基因编码的甾醇Δ7-还原酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。优选的，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。优选的，所述葡萄糖脱氢酶基因编码的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)将甾醇Δ7-还原酶基因插入到pESC-Trp质粒中，得到pESCTrp-Δ7Red2质粒；2)将葡萄糖脱氢酶基因插入到步骤1)得到的pESCTrp-Δ7Red2质粒中，得到pESCTrp-Δ7Red2-GDH质粒；3)将所述步骤2)得到的pESCTrp-Δ7Red2-GDH质粒导入酿酒酵母中，得到酿酒酵母工程菌。优选的，扩增甾醇Δ7-还原酶基因使用的引物包括Fhis49398引物和Rhis49398引物；所述Fhis49398引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述Rhis49398引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。优选的，扩增甾醇Δ7-还原酶基因使用的程序为：94℃2min；94℃20s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min。优选的，扩增葡萄糖脱氢酶基因使用的引物包括FBamH12276引物和RSal12276引物；所述FBamH12276引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，所述RSal12276引物的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述的酿酒酵母工程菌在制备菜籽甾醇中的应用。本专利技术提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本专利技术提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本专利技术中，所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇Δ7-还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子，利用甾醇Δ7-还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇，从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。附图说明图1为甾醇Δ7-还原酶Δ7-red基因PCR扩增结果，其中1：Δ7-red基因PCR扩增产物；M：DNA分子量标准；图2为质粒pESC-Trp双酶切结果，其中1：pESC-Trp酶切结果；M：DNA分子质量标准；图3为GDH基因PCR扩增结果，其中M：DNA质量标准DL2000，1：GDH基因PCR扩增结果。图4为质粒酶切结果，其中1：pESCTrp-Δ7Red2酶切结果；M：DNA分子量标准；图5为工程菌中Δ7-red基因PCR扩增结果，其中1-8：1-8号克隆；M：DNA分子量标准；箭头表示目的条带；图6为工程菌中GDH基因PCR扩增结果，其中1-8：1-8号克隆；M：DNA分子量标准；箭头表示目的条带；图7为酵母工程发酵产物HPLC检测结果，其中A，1：W303-1B[TrpΔ7-red+GDH]发酵产物检测结果；2：W303-1B发酵产物检测结果；3：标准品菜籽甾醇HPLC检测结果，箭头所指为新的产物峰；B：产物和标准品的紫外图谱；图8为发酵产物的高分辨质谱检测结果。具体实施方式本专利技术提供了一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。在本专利技术中，所述甾醇Δ7-还原酶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，具体如下：atggcggagactgtacattctccgatcgttacttacgcatcgatgttatcgcttctcgccttctgtccacctttcgtcattctcctatggtacacaatggttcatcaggatggttctgttactcagacctttggcttcttttgggagaatggagttcaaggacttatcaacatatggccaagacccactttgattgcttggaaaattatattttgctatggagcatttgaagctattcttcagctgcttctgcctggtaaaagagttgagggtccaatatctccagccggaaaccgaccagtttacaaggccaatggtctggctgcttactttgtgacactagcaacccatcttggtctttggtggtttggaatcttcaaccctgcaattgtctatgatcacttgggtgaaatattttcggcactaatattcggaagcttcatattttgtgttttgttgtacataaaaggccatgttgcaccttcatcaagtgactctggttcatgtggtaacctaataattgacttctattggggcatggagttgtaccctcgaattggtaagagctttgacatcaaggtgtttactaattgcagattcggaatgatgtcttgggcagttcttgcagtcacgtactgcataaaacagtatgaaataaatggcaaagtatctgattcaatgctggtgaacaccatcctgatgctggtgtatgtcacaaaattcttctggtgggaagctggttattggaacaccatggacattgcacatgaccgagctggattctatatatgctggggttgtctagtgtgggtgccttctgtctacacttctccaggcatgtaccttgtgaaccaccccgtcgaactcggaactcagttggcaatatacattctcgttgcaggaattctgtgcatttacataaagtatgactgtgatagacaaaggcaagagttcaggaggacaaacgggaaatgtttggtttggggaagagccccgtcaaagattgtggcgtcgtatactacaacatctggt本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。


2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述甾醇Δ7-还原酶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述甾醇Δ7-还原酶基因编码的甾醇Δ7-还原酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。


5.根据权利要求1或4所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶基因编码的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


6.权利要求1～5任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将甾醇Δ7-还原酶基因插入到pESC-Trp质粒中，得到pESCTrp-Δ7Red2质粒；
2)将葡萄糖脱氢酶基因插入到步骤1)得到的pESCTrp-Δ7Red2质粒中，得到pESCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭庆春，孔建强，董志鹏，苑立刚，褚倩倩，
申请(专利权)人：河北兰升生物科技有限公司，河北谷之润科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13