抗菌肽L7及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗菌肽L7及其应用，具有肽链长度短、稳定性较好、人工合成方便等特点。将抗菌肽L7的氨基酸序列经NCBI蛋白数据库搜寻比对，未发现有相同的多肽。抗菌肽L7具有广谱的抗菌活性，杀菌作用强，能够通过作用于细胞膜而发挥抗菌作用。此外，抗菌肽L7能呈剂量依赖性地抑制细菌生物膜的形成，以及具有溶血活性低和细胞毒性小等特点，因此可以作为一种新的治疗药物用于治疗细菌引起的感染。

Antimicrobial peptide L7 and its application

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽L7及其应用
本专利技术属于生物医学
，涉及抗菌肽L7及其应用。
技术介绍
近年来，随着抗生素的大量使用和滥用，大量耐药菌和多重耐药菌不断出现，给临床治疗带来了巨大困难。特别是最近南亚和美国超级细菌的出现标志着耐药菌在全世界范围内暴发流行。然而，近几十年来结构新颖的抗生素研发匮乏，仅研发出3种针对革兰氏阳性菌的新型抗生素。因此，寻找新的抗菌策略成为亟待解决的难题。抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子多肽，是天然免疫的主要组成成分。抗菌肽具有广谱的抗菌活性、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、免疫调节和信号转导等功能。传统的抗生素主要针对细菌的特定靶点和代谢通路发挥抗菌作用，容易使细菌发生突变而获得耐药性。而抗菌肽主要通过物理性破坏细菌的细胞膜结构，使细菌内容物外渗而死亡。由于细菌很难改变其全部细胞膜的组成和结构而对抗菌肽产生耐药性，因此，抗菌肽作为一种新的抗生素替代品有望解决细菌耐药的问题，具有广泛的应用价值。天然的抗菌肽具有分离纯化困难、抗菌活性不强、溶血活性和细胞毒性高、稳定性差等缺点，限制了其大量生产和在临床上的应用。因此，对抗菌肽的结构进行改良，设计一类分子量小、抗菌活性强、稳定性和安全性高、同时能够大量生产的抗菌肽是实现其在临床能够部分取代抗生素进行治疗的关键因素。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗菌肽L7及其应用，其分子量小、安全高效、成本相对较低，可为抗细菌感染提供一种新的治疗药物。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、抗菌肽L7，其氨基酸序列为RWWKWFK，如SEQIDNO.1所示，分子量为1136.4Da，可按所示序列采用多肽合成仪合成得到。2、上述抗菌肽L7在制备破坏细菌细胞膜或抑制细菌生物膜形成的药物中的应用。优选的，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。3、上述抗菌肽L7在制备用于治疗细菌感染的广谱抗菌药物中的应用。优选的，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所设计合成的抗菌肽L7为ɑ螺旋阳离子多肽，具有肽链长度短、稳定性较好、人工合成方便等特点。将抗菌肽L7的氨基酸序列经NCBI蛋白数据库搜寻比对，未发现有相同的多肽。抗菌肽L7具有广谱的抗菌活性，杀菌作用强，能够通过作用于细胞膜而发挥抗菌作用。此外，抗菌肽L7能呈剂量依赖性地抑制细菌生物膜的形成，以及具有溶血活性低和细胞毒性小等特点，因此可以作为一种新的治疗药物用于治疗细菌引起的感染。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为透射电镜观察1/4MIC抗菌肽对细胞形态的影响；其中，(A)铜绿假单胞菌ATCC27853空白对照组；(B)铜绿假单胞菌ATCC27853抗菌肽处理组；(C)金黄色葡萄球菌ATCC29213空白对照组；(D)金黄色葡萄球菌ATCC29213抗菌肽处理组；图2为亚抑菌浓度抗菌肽对细菌生物膜形成能力的影响(*P<0.05，**P<0.01vs.Control)，其中，A为铜绿假单胞菌ATCC27853，B为鲍曼不动杆菌aba659，C为金黄色葡萄球菌ATCC29213，D为表皮葡萄球菌ATCC35984；图3为抗菌肽对脱纤维绵羊红细胞的溶血活性；图4为抗菌肽对人支气管上皮细胞HBE的LDH释放率。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术以下实施例使用的标准菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984购自美国菌种保藏中心；其它均为临床菌株，由陆军军医大学西南医院检验科提供。人支气管上皮细胞HBE购自美国ATCC细胞库。脱纤维绵羊血、TritonX-100购自北京索莱宝科技有限公司，青霉素-链霉素购自上海碧云天生物技术有限公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。实施例：抗菌肽L7的合成抗菌肽L7含有7个氨基酸残基，其序列为精氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸，采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相化学合成方法，在多肽合成仪上从C端到N端逐一合成如SEQIDNO.1所示的多肽(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，固相支持剂为氯甲基聚苯乙烯树脂，流动相为二甲基甲酰胺/二氯甲烷(体积比1：1)。合成肽使用LC6000高效液相色谱仪，C18色谱柱(InertsilODS-SP4.6*250mm*5μm)进行纯化，收集产物峰获得纯度97.0％的L7多肽，真空干燥，称量，20mg/瓶分装，-20℃保存备用。然后进行质谱鉴定，分子量为1136.4Da，结果表明ESI-MSm/z:1137.5[M+H]和569.25[M+2H]，L7的分子离子峰与合成预期结果一致。抗菌肽L7的最低抑菌浓度(MIC)测定采用微量肉汤稀释法检测抗菌肽L7对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的MIC结果。抗菌肽首先用二甲基亚砜溶解，然后用MH肉汤倍比稀释成10个浓度梯度(512μg/mL-1μg/mL)。菌株划线接种在哥伦比亚血琼脂平板上，在37℃恒温培养箱中培养18小时后，用生理盐水稀释至0.5个麦氏比浊单位，然后再用MH肉汤稀释1000倍。在96孔板中每孔加入100μL系列浓度的抗菌肽溶液，然后每孔再加入100μL稀释菌液，使其药物终浓度为256μg/mL-0.5μg/mL；生长对照孔中加入100μLMH肉汤和100μL稀释菌液。将96孔板放置到37℃恒温培养箱中培养20小时，读取MIC结果，具体见表1。表1抗菌肽L7的抗菌活性如表1中所示，抗菌肽L7对受试的革兰氏阴性菌(鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯氏菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌)均具有较强的抗菌活性。抗菌肽L7对细菌细胞形态的影响由于1/2MIC对细菌生长有影响，因此本专利技术采用透射电镜观察1/4MIC抗菌肽对细菌细胞形态的影响。用无菌接种环分别挑取铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC29213单菌落于10mLLB肉汤，在37℃、180rpm条件下震荡培养18小时，得到菌液。空白对照组在锥形瓶中加入100μL菌液和9.9mLLB肉汤。抗菌肽组中加入100μL菌液、100μL抗菌肽和9.8mLLB肉汤，使其药物终浓度达到1/4MIC。样本在37℃、180rpm条件下震荡培养18小时后，各取1mL样本在10000rpm下离心15分钟。弃尽上清，加入1mL质量浓度2.5％戊二醛进行固定，然后送入电镜室进行样本处理、包埋、切片、染色。最后采用透射电镜放大50000倍进行观察拍照。由图1可以看出，铜绿假单胞菌ATCC27853空白对照组细胞结构完整，胞质密度均匀，胞外周围可见很多鞭毛；而抗菌肽处理组胞质颜色变淡，细胞膜结构松散，胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗菌肽L7，其特征在于，其氨基酸序列为RWWKWFK，如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗菌肽L7，其特征在于，其氨基酸序列为RWWKWFK，如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述抗菌肽L7在制备破坏细菌细胞膜或抑制细菌生物膜形成的药物中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙凤军，夏培元，冯伟，袁慊，王瑜，程林，姚璞，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50