一种肺炎链球菌疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物制品领域，公开了一种肺炎链球菌疫苗，包括SPD_0151蛋白和免疫佐剂，所述SPD_0151蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。所述SPD_0151蛋白的制备方法，包括以下步骤：在重组质粒中插入不含信号肽序列的spd_0151基因，导入表达菌，诱导表达，纯化，制得SPD_0151蛋白；所述spd_0151基因的序列为SEQ ID NO.2。所述肺炎链球菌疫苗对不同亚型的肺炎链球菌菌株的攻毒都有良好的保护作用，可有效增强对肺炎链球菌的抵抗力。

A vaccine of Streptococcus pneumoniae and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎链球菌疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物制品领域，特别涉及一种肺炎链球菌疫苗及其制备方法。
技术介绍
肺炎链球菌属于革兰氏阳性菌，常常寄居于正常人的口腔及鼻咽部，一般不致病，只形成带菌状态，只有在免疫力下降时才致病。肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见的致病菌之一，该细菌也会导致许多其他严重疾病，包括脑膜炎、中耳炎、菌血症和败血症等，特别是在儿童、老年人、艾滋病患者和其他免疫缺陷患者中，对全世界的人类健康构成重大威胁。而疫苗和抗生素是目前预防和治疗肺炎链球菌感染疾病的主要手段。目前市面上的肺炎链球菌疫苗主要是23价肺炎球菌多糖疫苗PPV23和13价肺炎球菌多糖结合疫苗PCV13。PPV23是目前唯一用于预防2岁以上儿童及高危人群感染肺炎链球菌的多糖疫苗，但是PPV23不能诱导2岁以下的婴幼儿产生保护性抗体；而接种PCV13虽然能用于预防5岁以下儿童的肺炎链球菌感染相关的疾病，但是其覆盖的血清型有限。而目前分离出的肺炎链球菌已有92个血清型，因此非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得研究者开始关注其他方向肺炎球菌疫苗的开发，其中开发存在于所有血清型中肺炎链球菌毒力蛋白和脂蛋白抗原成为研究的热点，如肺炎链球菌溶血素(Ply)、肺炎链球菌表面蛋白(PspA)、肺炎链球菌黏附素A(PsaA)、肺炎链球菌铁摄取脂蛋白PiaA和PiuA等。因此，不断开发和研究新型肺炎链球菌抗原，对于制备效果更好的肺炎链球菌疫苗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种肺炎链球菌疫苗及其制备方法。所述肺炎链球菌疫苗对不同亚型的肺炎链球菌菌株的攻毒都有良好的保护作用，可有效增强对肺炎链球菌的抵抗力。在革兰氏阳性菌中，脂蛋白是一类具有多种生物学功能的、重要的膜锚定蛋白，通常含有由18～36个氨基酸组成的信号肽。ABC转运系统的底物结合蛋白都是典型的脂蛋白，而且脂蛋白还具有参与营养物质吸收、信号转导、黏附、接合、孢子形成、参与抗生素抗性、细胞质外蛋白质的折叠、参与黏附宿主细胞、调节炎症进程、将毒力因子转入宿主细胞中等功能。由于脂蛋白是暴露在细胞膜外的，是许多革兰氏阳性菌所必需的毒力因子，而且人宿主细胞中不存在这些脂蛋白的同源蛋白，因此脂蛋白可成为这些细菌引发的感染性疾病的疫苗候选物和药物靶标。一种肺炎链球菌疫苗，包括SPD_0151蛋白和免疫佐剂，所述SPD_0151蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。所述SPD_0151蛋白属于肺炎链球菌脂蛋白的一种，其中SEQIDNO.1序列中不包含信号肽序列。试验表明，所述SPD_0151蛋白属于大分子蛋白质，具有较强的免疫原性，可诱导产生免疫应答。因此，所述肺炎链球菌抗原可应用于肺炎链球菌疫苗的制备。通过对肺炎链球菌各亚型的基因序列进行分析比对，表明spd_0151基因在肺炎链球菌的各种亚型中均高度保守，序列重复度最低为98.94％，最高可达99.65％。因此使用SPD_0151蛋白制得的疫苗应对所有肺炎链球菌亚型具有类似的保护效果。优选的，所述SPD_0151蛋白的浓度为20～200μg/mL。优选的，所述免疫佐剂的浓度为0.2～1mg/mL。优选的，所述免疫佐剂包括弗氏佐剂、铝佐剂或脂质体中的至少一种。更优选的，所述免疫佐剂为铝佐剂。所述铝佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾或钾明矾中的至少一种。优选的，所述肺炎链球菌疫苗还包括Ply、PspA、PsaA、PiaA或PiuA中的至少一种。所述Ply、PspA、PsaA、PiaA或PiuA均为可用于制备疫苗的蛋白抗原。一种SPD_0151蛋白的制备方法，包括以下步骤：在重组质粒中插入不含信号肽序列的spd_0151基因，导入表达菌，诱导表达，纯化，制得SPD_0151蛋白；所述spd_0151基因的序列为SEQIDNO.2。优选的，所述纯化的方法包括亲和层析、离子交换层析和或凝胶过滤层析中的至少一种。更优选的，所述纯化的方法为亲和层析。相对于现有技术，本专利技术的有益效果如下：(1)spd_0151基因在所有肺炎链球菌的亚型中均高度保守，因此含有SPD_0151蛋白的疫苗可用于预防不同亚型的肺炎链球菌的感染。(2)本专利技术所述疫苗还可通过添加Ply、PspA、PsaA、PiaA或PiuA等蛋白抗原，制得联合疫苗，用于预防肺炎链球菌感染所致的疾病。附图说明图1表示SPD_0151蛋白的分子量大小；图2表示免疫应答后血清中的IgG抗体滴度；图3表示血清中SPD_0151蛋白的抗体的特异性试验结果；图4表示实验组和对照组小鼠的生存曲线。具体实施方式为了让本领域技术人员更加清楚明白本专利技术所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本专利技术要求的保护范围不构成限制作用。实施例1一种肺炎链球菌抗原SPD_0151蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。其制备方法包括以下步骤：(1)将不含信号肽序列的spd-0151基因(其序列为SEQIDNO.2)连接到pGEX-4T-1载体上，获得表达载体pGEX-4T-0151；(2)将表达载体pGEX-4T-0151导入大肠杆菌中获得表达菌株；将表达菌株接种于含有100ng/μL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下振荡培养过夜，继续扩大培养；待表达菌株增殖至生长对数期OD600为0.6～0.8时，将IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)加入至培养体系中至质量浓度为0.5mmol/L，诱导表达6h，收集菌体，裂解获得蛋白质；(3)采用GST亲和层析对获得的蛋白质进行纯化，从而得到融合蛋白GST-0151；用10mmol/L还原型谷胱甘肽(pH8.0)将结合在GST亲和层析柱(GE公司，型号：17-0756-01)上的融合蛋白GST-0151洗脱下来，经10kDa的离心超滤管(Millipore公司，型号：UFC801096)浓缩后，运用凝血酶外切酶切去GST标签(谷胱甘肽巯基转移酶标签)，进一步通过GST亲和层析得到目的蛋白SPD_0151。实施例2实验组：实施例1中得到的目的蛋白SPD_0151与铝佐剂的混合物，该混合物中目的蛋白SPD_0151浓度为125μg/mL，铝佐剂的浓度为0.5mg/mL，其中所用铝佐剂的成分为氢氧化铝；对照组：1×PBS与铝佐剂的混合物，该混合物中铝佐剂的浓度为0.5mg/mL，其中所用铝佐剂的成分为氢氧化铝。使用上述实验组和对照组对BALB/c小白鼠多位点进行皮下注射，注射量为25μg/只小鼠，每组10只小鼠，共免疫三次，每次免疫间隔14天。第三次免疫完成7天后，通过酶联免疫吸附测定小鼠血清中的抗体效价。通常，蛋白质疫苗引起的免疫应答为体液免疫，体液免疫过程中，机体在血清中产生IgG抗体通过不同机制去本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺炎链球菌疫苗，其特征在于，包括SPD_0151蛋白和免疫佐剂，所述SPD_0151蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种肺炎链球菌疫苗，其特征在于，包括SPD_0151蛋白和免疫佐剂，所述SPD_0151蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。


2.根据权利要求1所述的肺炎链球菌疫苗，其特征在于，所述SPD_0151蛋白的浓度为25～200μg/mL。


3.根据权利要求1所述的肺炎链球菌疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂的浓度为0.2～1mg/mL。


4.根据权利要求1所述的肺炎链球菌疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂包括弗氏佐剂、铝佐剂或脂质体中的至少一种。


5.根据权利要求4所述的肺炎链球菌疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为铝佐剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：阳小燕，乐尧金，
申请(专利权)人：遵义医科大学珠海校区，
类型：发明
国别省市：广东;44