一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及医学检测技术领域，具体涉及一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法。该引物和探针包括：SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。本发明专利技术提供的引物和探针能够特异性与生殖支原体外膜蛋白B基因、人β珠蛋白基因相结合，显著提高了检测的灵敏度和特异性，对低值样本的检出率达100％，检测结果准确可靠，可应用于临床生殖支原体的检测。

A primer, probe, kit and detection method for detection of Mycoplasma genitalium

【技术实现步骤摘要】
一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
生殖支原体(Mycoplasmagenitalium，MG)属于支原体科柔膜菌纲，是导致非淋菌性尿道炎(non-gonococcalurethritis，NGU)的病原体之一。此外，MG与盆腔炎性疾病(pelvicinflammatorydisease，PID)、产科并发症、前列腺炎、附睾炎以及包皮龟头炎等性传播疾病密切相关。近年来，研究发现，MG感染还可能与肿瘤及人类免疫缺陷病毒(HIV)的发生发展有关。2016欧洲生殖支原体感染指南指出，生殖支原体在男性非衣原体性非淋球菌性尿道炎(NCNGU)中的流行率为10％-35％。在国内，生殖支原体在性病门诊感染率为4.0-19.4％。在女性生殖支原体感染中，30.4％同时合并感染淋病，25.0％合并感染衣原体。此外，HIV感染中有2-33％人合并感染生殖支原体。近年来由于MG感染的流行以及检测技术的不断进步，MG已经成为了性传播疾病中的重要病原体之一。MG的检测方法包括：分离培养法、血清学方法及分子生物学方法。分离培养是诊断生殖支原体感染的“金标准”，但是MG培养成功率极低且周期较长。血清学检测方法因MG与肺炎支原体(MycoplasmaPneumonia，Mp)的抗原存在交叉反应而缺乏特异性在实际应用上受到一定限制。近年来，核酸检测技术以其灵敏度高，特异性强，检测范围宽，易于实现自动化等优势在疾病检测方面应用越来越越广泛。目前，国内基于PCR技术检测MG的试剂盒较少，且自动化程度不高，检测时间较长，假阴性较高，因此，开发一种灵敏度高，检测时间短，假阳性低，简便快捷的试剂盒是亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法，该试剂盒检测生殖支原体的灵敏度高、特异性好、检测时间短。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种用于检测生殖支原体的引物和探针，包括：SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针。本专利技术通过比对GeenBank数据库收录全部生殖支原体基因组序列，针对生殖支原体外膜蛋白B基因设计了SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针，其中：SEQIDNO:1：5’-AGCCTTACCACACCTTCGTAG-3’SEQIDNO:2：5’-TGGCATTCTTTGTTTGCATTGGAG-3’；SEQIDNO:3：5’-AGGGATCACCCATGCAGGGAGT-3’。一些实施方案中，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术还提供了检测生殖支原体的试剂盒，包括本专利技术所述的引物和探针。本专利技术提供的试剂盒还包括用于检测内参基因的SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针，针对人β珠蛋白基因设计，其中：SEQIDNO:4：5’-TGGAACATATTTGACGGCTTT-3’SEQIDNO:5：5’-GATCTTAGCTACTACTGCCAA-3’SEQIDNO:6：5’-AAACCCACTGCATCACTCT-3’。SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。本专利技术提供的试剂盒还包括反应液1和反应液2；所述反应液1包括基础缓冲液、阳离子、增强剂和酶；所述反应液2包括P300和MnCl2。一些实施方案中，所述基础缓冲液为含BSA的Tris-HCl缓冲液，所述阳离子为Mn2+、K+中的一种或两种，所述增强剂包括甘油、DMSO、Tween20、TricineX-100、乙酸钾和甜菜碱中的一种或多种，所述酶为双功能酶和/或UNG酶。双功能酶是一种既有RNA反转录功能又有DNA聚合酶功能的酶，主要包括TthDNA聚合酶、TflDNA聚合酶以及重组和改进的相关酶。本专利技术试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为含人β珠蛋白基因片段的质粒，所述阳性质控品包括含MG外膜蛋白B基因片段的质粒和人β珠蛋白基因片段的质粒。本专利技术还提供一种生殖支原体的检测方法，包括：利用本专利技术试剂盒对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR的体系包括：一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR的体系中，各引物的浓度为20～35pmol/μl，各探针的浓度为10～20pmol/μl。一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR的程序包括：50℃2分钟；96℃2分钟预变性；96℃6秒→60℃15秒，共45个循环。本专利技术检测生殖支原体的引物和探针包括：SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针；和SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物对和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。本专利技术试剂盒采用人β珠蛋白基因作为内参，监测采样过程是否异常；结合针对生殖支原体外膜蛋白B基因设计的特异性引物、探针，保证了较高的灵敏度，可检测低至50Copies/ml的病原体，检测时间短，整个扩增检测过程可在45分钟内完成；与肺炎支原体、人型支原体等种属相近的病原体无交叉反应，常见治疗药物如多西环素、阿奇霉素、莫西沙星、左氧氟沙星对检测结果无影响，具有较强的特异性，同时对低值样本检出率达100％，检测结果准确可靠，可应用于临床生殖支原体的检测。具体实施方式本专利技术公开了一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本专利技术。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本专利技术的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本专利技术将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。本专利技术提供的一种检测生殖支原体的引物和探针、试剂盒及检测方法中所用材料或试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1本专利技术引物和探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测生殖支原体的引物和探针，其特征在于，包括：/nSEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测生殖支原体的引物和探针，其特征在于，包括：
SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针。


2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。


3.检测生殖支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物和探针。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测内参基因的SEQIDNO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒针，其特征在于，SEQIDNO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。


6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应液1和反应液2；所述反应液1包括基础缓冲液、阳离子、增强剂和酶；所述反应液2包括ProClin300和MnCl2。

【专利技术属性】
技术研发人员：胡进，李振红，李静静，杜美，鲁清月，付光宇，吴学炜，苗拥军，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41