结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术提供了一种结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA、检测试剂盒与检测方法，所述crRNA包括：KRAS‑exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.14‑16任一所示；KRAS‑exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.17‑18任一所示；NRAS‑exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.19‑20任一所示；BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.21‑22任一所示。本发明专利技术设计与结肠癌相关分子标志物突变靶点的4个crRNA，结合CRISPR‑cpf1系统进行突变检测，此方法具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。

Detection kit and method of gene mutation of colon cancer related molecular marker

【技术实现步骤摘要】
结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法。
技术介绍
肿瘤是人体在各种不良因素的作用下，身体里某个或者某些部位组织中的细胞发生异常增生而形成的新生物，发生异常增生的细胞就是肿瘤细胞。结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发生率高居全球恶性肿瘤第四位，年累及人数约100万，年死亡人数近50万。尽管结直肠息肉和癌症早期可能不会有症状，简单的筛查可以发现许多赘生物和息肉。用乙状结肠镜和结肠镜可以发现和切除结直肠息肉，降低其发展为癌症的风险。然而仍然发现较晚会有风险，因此准确获知肿瘤的生物学信息，从而在基因分型指导下进行个体化治疗对于指导临床用药至关重要。结肠癌发病率最为常见的是部分基因的突变会导致结肠癌的产生，如在部分患者中能检测到KRAS、NRAS、BRAF等等基因发生突变，将对结直肠癌的早期检测与预防具有极大的意义。然而目前在现阶段临床可通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitativerealtimepolymerasechainreaction，Q-PCR)、非放射性原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，Fish)、多重引物PCR(multiplexPCR)等方式对患者进行相关位点的基因突变检测，这些技术存在一次只能检测一个基因或检测成本高等问题，而且无法应用到大规模的临床样本研究，因此，亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。r>
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法，特异性强，灵敏度高，最低检测极限达到10拷贝/uL。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crDNA，所述crDNA包括：KRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.5-7任一所示；KRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.8-9任一所示；NRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.10-11任一所示；BRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.12-13任一所示。本专利技术的目的之二在于提供一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA，所述crRNA包括：KRAS-exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.14-16任一所示；KRAS-exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.17-18任一所示；NRAS-exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.19-20任一所示；BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.21-22任一所示。本专利技术的目的之三在于提供一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，含有所述crDNA或者所述的crRNA。优选地，所述试剂盒还包括cpf1蛋白和荧光探针。优选地，所述荧光探针选自如下探针中的一个：荧光探针1：其序列如SEQIDNO.23所示；荧光探针2：其序列如SEQIDNO.24所示；荧光探针3：其序列如SEQIDNO.25所示；所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和TexasRed中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。优选地，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。优选地，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒或实时荧光定量检测试剂盒。本专利技术的目的之四在于提供所述的crRNA、以及所述的试剂盒在用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变上的用途。本专利技术的目的之五在于提供一种一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测方法，包括如下步骤：S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；S2、将所述的扩增产物、crRNA、cpf1蛋白、SEQIDNO.23-25任一所示的荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。优选地，将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测或者将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。作为以上实施方式之一，将扩增产物、cpf1蛋白/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区。本专利技术提供了一种基于CRISPR-cpf1系统以胶体金可视化检测荧光基团，以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便，无需仪器，具有很强的适用范围和场所，实用性极强。作为以上另一种优选方式之一，将扩增产物、cpf1/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后荧光检测仪测定荧光值。可以做成便携式检测仪可以随时随地及时检测，这些应用和方法为后续试剂盒的开发，临床诊断的应用提供了平台，适用于大规模临床样本检测。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和效果：本专利技术提供的用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA、试剂盒及检测方法，设计与人基因突变靶点相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR-cpf1系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL；)、特异，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到含有相应突变的目标核酸：(1)在对KRAS-exon2的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。(2)在对KRAS-exon3的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。(3)在对NRAS-exon2的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。(4)在对BRAF的检测中，反应进行到20-30分钟时，突变型基因的荧光信号就明显高于野生型基因。该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。附图说明图1为KRAS-exon2的特异性检测结果；图2为KRAS-exon3的特异性检测结果；图3为NRAS-exon2的特异性检测结果；图4为BRAF的特异性检测结果；图5为KRAS-exon2的灵敏性检测结果；图6为KRAS-exon3的灵敏性检测结果；图7为NRAS-exon2的灵敏性检测结果；图8为BRAF的灵敏性检测结果。具体实施方式...

【技术保护点】
1.一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crDNA，其特征在于，所述crDNA包括：/nKRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.5-7任一所示；/nKRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.8-9任一所示；/nNRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.10-11任一所示；/nBRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.12-13任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crDNA，其特征在于，所述crDNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.5-7任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.8-9任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.10-11任一所示；
BRAF基因突变位点的crDNA：其序列如SEQIDNO.12-13任一所示。


2.一种用于检测结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括：
KRAS-exon2突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.14-16任一所示；
KRAS-exon3突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.17-18任一所示；
NRAS-exon2基因突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.19-20所示；
BRAF基因突变位点的crRNA：其序列如SEQIDNO.21-22所示。


3.一种结肠癌相关分子标志物基因突变的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述crDNA或权利要求2所述的crRNA。


4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cpf1蛋白和荧光探针。


5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚杰，程诚，王恩慧，赵洪友，
申请(专利权)人：武汉博杰生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42