基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒力基因PagN制备多克隆抗体与羧基化磁珠偶联构建免疫磁珠，与荧光定量PCR检测方法联用，避免了传统培养法中复杂耗时等问题，此方法快速有效、成本经济，即时可见，可以实现特异性检测与定量食品中的沙门氏菌。

Rapid detection of Salmonella foodborne based on pagn gene

【技术实现步骤摘要】
基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法
本专利技术属于生物
，涉及食源性致病菌--沙门氏菌的检测。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonellasp.)是一种能够引起人兽共患，寄生于动物和人类肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，1885年Salmon在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，至今为止沙门氏菌共具有六种肠道亚型，已发现有2600多种肠道血清型，最常见的血清型为肠道沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱杆菌等，饮食如猪肉、牛奶等是感染沙门氏菌的常见途径，感染沙门氏菌的食物口服后经口腔进入体内，后经淋巴系统进入血液，其对入侵的沙门氏菌发生抵御，菌体被破坏并释放内毒素，对细胞和组织产生一系列感染，主要感染症状为持续发热、腹泻、呕吐等，严重可引起伤寒、菌血症和全身感染。在我国食源性疾病中分离出病原体沙门氏菌的检出率一直高居不下，在美国每年约有150万人感染死亡比例高达39％，在越南肉食类食物中沙门氏菌检出率约为41.1％，因此沙门氏菌成为全球公共卫生问题。世界卫生组织也已将沙门氏菌的检验列为必不可少的检测指标，相关技术发展迅速，传统培养法是目前大多数国家检测沙门菌的基本手段，通过选择性增菌进行分离及生化鉴定，但其培养过程过于复杂耗时；分子生物学方法从核酸水平实现对病原体的检测，其具有较高的准确性和灵敏度，如基因芯片技术、基因探针、聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等；免疫学检测技术近几年被应用广泛，利用抗原抗体的特异性结合实现病原体的快速检测，例如酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)、免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)、免疫胶体金技术、免疫磁珠分离技术(immunomagneticbeadseparationtechnology,IMB)等。但目前的检测技术存在检出限不高、检测时间冗长的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，解决现有技术中检出限不高、时间冗长，弥补单一检测技术不足等问题。本专利技术的技术方案包括：一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。具体包括以下步骤：(1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQIDNo.1)，下游引物为：5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQIDNo.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；(2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；(3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；(4)PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)，1％牛血清白蛋白进行封闭；(5)免疫磁珠捕获沙门氏菌效率优化，摸索最佳捕获时间、捕获温度、免疫磁珠与多克隆抗体用量、沙门氏菌最适浓度；(6)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备的PagN免疫磁珠0.2mg,与合适稀释度的沙门氏菌待测液1mL,室温孵育50min,磁力架回收磁珠分离3-5min，分别取捕获前后上清液进行活菌计数，计算捕获效率；(7)荧光定量标准曲线的建立，选取沙门氏菌灵敏度较高的invA基因作为检测引物，上游引物为：5‘-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3’(SEQIDNo.3)，下游引物为：5‘-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3’(SEQIDNo.4)；(8)IMBs-qPCR联用检测食品中沙门氏菌：牛奶、猪肉样品预增菌进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于qPCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。所述步骤(5)捕获沙门氏菌效率优化参数为：30μLPagN多克隆抗体与2mg免疫磁珠偶联4h，沙门氏菌浓度102-105CFU/mL。基于以上方法，本专利技术请求保护所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌IMBs-qPCR技术，实验所用食品均为优选牛奶、猪肉。本专利技术有益效果：首先，本专利技术专利技术人设计了特异于沙门氏菌的PagN基因引物，该基因存在于大多数沙门氏菌中具有广谱性，根据此特点PCR扩增出PagN目的片段，纯化出目的蛋白制备多克隆抗体，该抗体可以特异性识别沙门氏菌PagN外膜蛋白上的抗原表位，避免了对其他干扰菌株捕获的可能，保证检测结果的有效性和准确性。其次，本专利技术采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠，通过三次重复试验平板计数结果发现，0.1mg免疫磁珠的捕获能力在沙门氏菌浓度为3.8×102-3.8×105CFU/mL时可达80％以上，对非沙门氏菌对捕获效率低于10％。此方法提高了捕获效率的特异性，重复性高，便于应用。最后，本专利技术所检测的沙门氏菌只需要用免疫磁珠去捕获，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，该复合物在磁力架的作用下发生定向力学移动，将其与杂质分开，达到富集的目的。收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测，根据Ct值结合标准曲线就可精确推算出其捕获的菌落数，并且在食品样品中进一步验证，可用于基层检测机构，便于推广。该方法检测时间短、方便快捷、经济有效，又具备PCR扩增的高度灵敏性特点，结果判断较为直观。本专利技术选取免疫磁珠与荧光定量PCR联用技术，利用免疫磁珠这一超顺磁性高分子复合物与免疫雄性兔子制备的针对于沙门氏菌外膜蛋白多克隆抗体通过EDC/NHS法进行共价偶联，实现对沙门氏菌的快速分离并结合荧光定量分析，制备的沙门氏菌外膜蛋白多克隆抗体提高捕获的特异性，设计荧光定量检测引物大大提高其灵敏度。附图说明图1：沙门氏菌PagN基因的PCR扩增电泳图；图2：原核重组蛋白pET-28a-PagN在大肠杆菌中表达纯化；图3：免疫磁珠制备及参数优化折线图；其中A为PagN多克隆抗体与免疫磁珠偶联时间，B为不同用量免疫磁珠对沙门菌捕获效率的影响，C为免疫磁珠对不同浓度沙门氏菌的捕获效率折线图；图4：免疫磁珠与沙门菌复合物扫描电镜图；其中A为伤寒沙门氏菌CMCC50619，B为免疫磁珠，C为免疫磁珠与沙门菌复合物；图5:荧光定量PCR标准曲线的稳定性评估；其中A为沙门氏菌荧光定量PCR标准曲线的建立，B为标准曲线稳定性评估；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。


2.根据权利要求1所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：
5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQIDNo.1)，下游引物为：
5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQIDNo.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；
(2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；
(3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；
(4)PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金海，华德平，付雅莉，张蕾，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12