自主异花授粉及自主单性结实番茄的培育方法技术

本发明专利技术属于植物育种领域，提供了番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法等。

The cultivation method of self pollination and self parthenocarpy tomato

【技术实现步骤摘要】
自主异花授粉及自主单性结实番茄的培育方法
本专利技术属于植物育种领域，具体而言，本专利技术涉及番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法等。
技术介绍
番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中国是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。作为未来市场占据主导地位的蔬菜，番茄在生产、栽培等方面仍存在两个重大难题：1、设施栽培番茄特定环境下保产成本的限制（坐果率低，需人工点花）；2、杂交种生产过程中纯度、成本、人力的限制（柱头无外露，需人工去雄）。而且，番茄的生长受温度影响很大，因此番茄非正常季的种植目前以设施栽培为主。而温室大棚由于温度控制不好、光照不足、缺少风或虫媒传粉等，会影响番茄受精结实，从而造成番茄大面积的落花落果，最终影响产量。在番茄种植中，一般采用以下传统途径提高坐果率：1）授粉刺激，即给番茄柱头授以不亲和花粉或无活力花粉，虽未受精但由于授粉本身的刺激可形成单性结实果；2）振动植株，即通过人工振动植株或振动花序刺激子房发育诱导形成单性结实果；3）化学诱导，即在花柄或花梗处涂抹赤霉素等激素，可以诱导番茄单性结实，也就是常说的“点花”，目前番茄种植中采用最多的是“点花法”。但是，上述所有的传统单性结实方法都具有操作复杂、单性结实率低、激素浓度难掌握、耗费人力物力等缺点，给番茄生产带来长期的困扰，并大大提高了种植成本。本专利技术人经过艰苦研究，利用现代分子生物学技术，培育出番茄自主单性结实系，该系具有自主性单性结实（无需点花或授粉）、坐果率高（尤其是高低温环境）、柱头外露等性状，且无其他不良性状的产生。在培育出番茄自主单性结实系后，本专利技术人继续研发，进一步培育出番茄自主异花授粉自主单性结实系，不会产生花粉且可以自主进行单性结实，需要恢复系进行常规种的繁种。另外，多数番茄天然表现为紫色茎秆，但是本专利技术人培育的番茄自主异花授粉自主单性结实系表现为绿色茎秆，因而可以用于在苗期快速鉴定出它。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的番茄自主单性结实系的培育方法和番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法。另外，本专利技术还提供了番茄自主异花授粉自主单性结实系的繁育方法以及核酸在培育番茄自主单性结实系或番茄自主异花授粉自主单性结实系中的应用等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了番茄自主单性结实系的培育方法，其包括：（1）构建敲除番茄染色体上3个靶位点的载体，其中所述靶位点是核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、2和3所示的核酸；（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。优选在本专利技术第一方面的培育方法中，所述敲除的方式是通过CRISPR/Cas9技术敲除。现在已经有商用的基于CRISPR/Cas9技术的载体。在本专利技术的具体实施方式中，利用引物AGL6-sg-F、AGL6-sg-R、AGL6-U6-F、AGL6-U6-R2、AGL6-sgRNA-F2、AGL6-sgRNA-R、AGL6-U6-R3和AGL6-sgRNA-F3通过PCR将针对上述靶位点的核酸构建到BGK01载体上，形成敲除载体。优选在本专利技术第一方面的培育方法中，所述导入的方式是农杆菌侵染。农杆菌侵染将外源基因导入植物是本领域技术人员所熟悉的。导入了外源基因的植物外植体或细胞在植物培养基上培育，出芽，生根，长成植株。优选在本专利技术第一方面的培育方法中，所述筛选的方式是通过PCR来筛选。PCR是本领域技术人员所熟悉的。在本专利技术的具体实施方式中，利用引物Cas9-F和Cas9-R通过PCR可以鉴定出敲除阳性的株系；进一步地，利用引物AGL6-F1和AGL6-R1通过PCR可以鉴定区分出敲除纯合和敲除杂合的株系。核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、2和3所示的核酸均敲除纯合的株系作为本专利技术第一方面的培育方法培育的番茄自主单性结实系。在第二方面，本专利技术还提供了本专利技术第一方面的培育方法培育的番茄自主单性结实系的插入-缺失鉴定引物，其包括AGL6-鉴定-F3：5’-AGCTTGACTCCCATACACCT-3’和AGL6-鉴定-R3：5’-TGCTTCAAACTTGGCCTTTA-3’。使用该对引物，可以有效的区分本专利技术第一方面的培育方法培育的番茄自主单性结实系的突变类型。相应地，在第三方面，本专利技术还提供了利用本专利技术第二方面的插入-缺失鉴定引物鉴定本专利技术第一方面的培育方法培育的番茄自主单性结实系的突变类型的方法，其包括使用本专利技术第二方面的插入-缺失鉴定引物对本专利技术第一方面的培育方法培育的番茄DNA进行PCR。在第四方面，本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO：1、2和3之任一或组合所示的核酸在培育番茄自主单性结实系中的应用。优选本专利技术第四方面的应用是核苷酸序列如SEQIDNO：1、2和3（的组合）所示的核酸在培育番茄自主单性结实系中的应用。在第五方面，本专利技术提供了番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法，其包括：（1）构建敲除番茄染色体上靶位点的载体，其中所述靶位点包括核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的核酸和核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的核酸；（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。优选在本专利技术第五方面的培育方法中，所述敲除的方式是通过CRISPR/Cas9技术敲除。现在已经有报道基于CRISPR/Cas9技术的载体。本专利技术人将现有的CPB载体中的Cas9的启动子pUBI替换为pYao启动子，获得YBK载体，用于番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育。本专利技术人发现，使用这样的载体能减少植株嵌合体和体细胞编辑的概率，比现有商用的载体更适合用于本专利技术第五方面的培育方法中。在本专利技术的具体实施方式中，利用引物Ms10-U6-F、Ms10-U6-R、Ms10-sgRNA-F、Ms10-sgRNA-R、AGL6-U6-F4、AGL6-U6-R4、AGL6-sgRNA-F4和AGL6-sgRNA-R4通过PCR将针对上述靶位点的核酸构建到pYao载体上，形成敲除载体。优选在本专利技术第五方面的培育方法中，所述导入的方式是农杆菌侵染。农杆菌侵染将外源基因导入植物是本领域技术人员所熟悉的。导入了外源基因的植物外植体或细胞在植物培养基上培育，出芽，生根，长成植株。优选在本专利技术第五方面的培育方法中，所述筛选的方式是通过PCR来筛选。PCR是本领域技术人员所熟悉的。在本专利技术的具体实施方式中，利用引物Cas9-F和Cas9-R通过PCR可以鉴定出敲除阳性的株系；进一步地，利用引物Ms10-鉴定-F和Ms10-鉴定-R通过PCR及测序可以鉴定区分出核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的核酸敲除纯合和敲除杂合的株系，利用引物AGL6-鉴定-F2和AGL6-鉴定-R2通过PCR可以鉴定区分出核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的核酸敲除纯合和敲除杂合的株系。核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.番茄自主单性结实系的培育方法，其包括：/n（1）构建敲除番茄染色体上3个靶位点的载体，其中所述靶位点是核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、2和3所示的核酸；/n（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，/n（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。/n

【技术特征摘要】
1.番茄自主单性结实系的培育方法，其包括：
（1）构建敲除番茄染色体上3个靶位点的载体，其中所述靶位点是核苷酸序列分别如SEQIDNO：1、2和3所示的核酸；
（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，
（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。


2.番茄自主异花授粉自主单性结实系的培育方法，其包括：
（1）构建敲除番茄染色体上靶位点的载体，其中所述靶位点包括核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的核酸和核苷酸序列如SEQIDNO：2所示的核酸；
（2）将步骤（1）获得的载体导入番茄外植体；和，
（3）培养步骤（2）获得的外植体，筛选出敲除阳性的株系。


3.权利要求2所述的培育方法，其中，所述靶位点还包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：7和8所示的核酸。


4.权利要求2所述的培育方法，其中，核苷酸序列如SEQIDNO：6所示的靶位点纯合敲除的株系是自主异花授粉自主单性结实系，核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓帅，王喜萍，张从省，公小君，
申请(专利权)人：潍坊兴旺生物种业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37