一种土鳖虫多糖的结构及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种土鳖虫多糖的结构及其用途，利用化学分析和波谱技术对其结构进行鉴定，发现本发明专利技术中的ESPS的重复单元结构中主链主要由→4)‑α‑D‑Glcp‑(1→的葡萄糖和→3)‑Galp‑(1→的半乳糖组成，且支链通过葡萄糖的O‑6键、半乳糖的O‑4键和O‑6键连接在主链上，即ESPS为首次从土鳖虫中分离得到的一种结构新颖的杂多糖。同时，本发明专利技术中的ESPS可刺激脾淋巴细胞的增殖，也可促进淋巴细胞及NK细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用，表明多糖ESPS具有促进免疫和抗肿瘤作用。

Structure and application of a woodlouse polysaccharide

【技术实现步骤摘要】
一种土鳖虫多糖的结构及其用途
本专利技术涉及一种动物中药材中化合物，具体是由→4)-α-D-Glcp-(1→的葡萄糖和→3)-Galp-(1→的半乳糖组成的葡萄半乳聚糖主链结构的土鳖虫多糖(ESPS)以及用途。
技术介绍
土鳖虫多糖是从传统中药材土鳖虫中提取出的一种天然动物多糖。据《本草纲目》记载土鳖虫具有破血淤，散坚结，解凝治血，接骨续筋，消肿止痛等功能。近年研究结果表明，土鳖虫不仅是一种珍贵的中药材，而且还含有抗凝血，抗肿瘤等多种活性天然成分。多糖作为生物体的主要组成成分，广泛存在于动物，植物，微生物，是自然界含量最多的高分子聚合物。随着医药学以及细胞生物学技术发展，近年来研究者们不断对多糖进行深入研究。多糖具有多种生物活性，但对细胞组织毒性甚微，因而展现出非常广阔的发展前景。近年来对多糖的研究主要集中在其免疫活性及抗肿瘤活性，也有研究致力于多糖降血糖，降血脂，抗氧化，抗病毒等多种生物活性。多糖作为免疫治疗药物其作用机制主要集中于多糖能够促进相关免疫细胞因子分泌，激活T细胞，自然杀伤(NK)细胞，树突状细胞(DC)等相关免疫细胞，提高宿主免疫力以达到间接抗肿瘤作用。目前国内外已批准临床应用的多糖有香菇多糖、云芝多糖等，多糖的研究范围主要集中在其结构表征和生物功能，并将其应用于医药行业。随着对多糖构效关系的逐步深入探究，旨在发现具有良好生物学活性的新型多糖，多糖化合物的生物学活性研究得以迅速发展。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种土鳖虫多糖，为首次从土鳖虫中分离到的杂多糖。本专利技术另一个目的是提供该多糖的提取方法。本专利技术还有一个目的是指出该多糖具有显著的免疫增强和抗肿瘤活性，尤其对于肝癌和胰腺癌有良好的治疗作用，可以制备成相关药物。技术方案：本专利技术所述土鳖虫多糖，其特征在于由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为7.4:3.1:13.9:9.3:39.7:26.5；相对分子量为2.14×104Da；具有葡萄半乳聚糖主链结构，其重复单元的结构中主链由→4)-α-D-Glcp-(1→的葡萄糖和→3)-Galp-(1→的半乳糖组成，支链通过葡萄糖的O-6键，半乳糖的O-4键和O-6键连接在主链上，所述的主链单元结构及支链片段如图12所示。所述的土鳖虫多糖含有吡喃糖环。所述的土鳖虫多糖，通过以下方法制备：1.分离步骤：土鳖虫粉末经过水抽提、除蛋白、乙醇沉淀；2.纯化步骤：(1)取经水提，Sevag试剂联合木瓜蛋白酶除蛋白，醇沉制得的土鳖虫多糖粗品，充分溶解于去离子水，用已平衡好的离子交换柱CelluloseDE-52进行多糖粗品的洗脱；(2)将离子交换柱分离所得土鳖虫多糖水洗组分用SephacrylS-300分子筛柱凝胶层析，以去离子水洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；冷冻干燥，得到土鳖虫多糖。所述土鳖虫多糖的提取方法，包括分离和纯化，分离是将土鳖虫粉末经过水抽提、除蛋白、乙醇沉淀步骤，其特征在于纯化使用柱层析方法，具体包括下列步骤：(1)取经水提，Sevag试剂联合木瓜蛋白酶除蛋白，醇沉制得的土鳖虫多糖粗品，充分溶解于去离子水，用已平衡好的离子交换柱CelluloseDE-52进行多糖粗品的洗脱；(2)将离子交换柱分离所得土鳖虫多糖水洗组分用SephacrylS-300分子筛凝胶层析，以去离子水洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分；冷冻干燥，得到土鳖虫多糖。所述的土鳖虫多糖在制备免疫增强剂中的应用。所述的土鳖虫多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用。所述的土鳖虫多糖在制备治疗肝癌和胰腺癌药物中的应用。上述ESPS在不同浓度下(25-800μg/ml)可明显促进脾淋巴细胞增殖，且作用呈一定剂量依赖性；并且在3.1-800μg/ml浓度下对多种正常细胞无明显细胞毒作用。效靶比实验结果说明ESPS可促进淋巴细胞及NK细胞对多种肿瘤的杀伤作用。体内实验说明ESPS具有抗H22及Panc02荷瘤作用，脾指数与胸腺指数与化疗阳性药组相比均具有显著上升，并且，Elisa实验说明给药ESPS后能明显提高小鼠血清中IL-2，IFN-γ含量。有益效果：该土鳖虫多糖ESPS是首次从土鳖虫中分离到的一种结构新颖的杂多糖。同时，本专利技术中的ESPS可刺激脾淋巴细胞的增殖，也可促进淋巴细胞及NK细胞对多种肿瘤的杀伤作用，表明本专利技术中的ESPS具有促免疫抗肿瘤作用。附图说明图1为本专利技术中土鳖虫多糖(ESPS)提取流程图；图2为本专利技术中ESPS分子量标准曲线及液相图谱；图3为本专利技术中ESPS单糖组成GC-MS图谱；图4为本专利技术中ESPS甲基化分析GC-MS图谱；图5为本专利技术中ESPS的紫外分光光谱；图6为本专利技术中ESPS的红外分光光谱；图7为本专利技术中ESPS的1HNMR图谱；图8为本专利技术中ESPS的13CNMR图谱；图9为本专利技术中ESPS的1H-1HCOSY图谱；图10为本专利技术中ESPS的HSQC图谱；图11为本专利技术中ESPS的NOESY图谱；图12为本专利技术中ESPS的主链重复单元及支链片段；图13为本专利技术中ESPS促进脾淋巴细胞增殖的示意图；图14为本专利技术中ESPS体外对多种肿瘤细胞及正常细胞生长的示意图；图15为本专利技术中ESPS激活鼠脾淋巴细胞对Yac-1，CT-26，Panc02肿瘤细胞的杀伤作用的示意图；图16为本专利技术中ESPS激活NK-92对Panc-1，HepG2，A375，MCF-7肿瘤细胞的杀伤作用的示意图；图17为本专利技术中ESPS体内对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的示意图；图18为本专利技术中ESPS体内对Panc02荷瘤小鼠抗肿瘤作用的示意图；图19为本专利技术中ESPS促进Panc02荷瘤小鼠血清中IL-2，IFN-γ细胞因子分泌的示意图。具体实施方式实施例11.分离纯化流程分离：(1)使用中药粉碎机对土鳖虫进行粉碎，经粉碎后过40目筛，将收集到的500g土鳖虫粉末按照1:10(w/v)比例置于5L蒸馏水中，90℃提取3小时，反复3次，合并水提液共15L，40℃减压浓缩至1L。(2)向浓缩液中加入木瓜蛋白酶10g，60℃水浴6h。利用Sevag法除蛋白，10-15次。加入1/5体积预先配制的Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝5:1)，在摇床上震荡15min，8000rpm离心15min，取上清，重复上述步骤直至水和氯仿中间的界面无蛋白沉淀产生。40℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液体积浓缩至200ml。(3)向除去蛋白的浓缩液中缓慢加入1L预冷至4℃的无水乙醇，并在4℃下静置过夜沉淀多糖，用布氏漏斗抽滤，用无水乙醇洗涤沉淀2次。将粗多糖溶解于50ml蒸馏水中，冷冻干燥后得到粗多糖10.4g。纯化：取粗多糖3g配成50mg/mL的水溶液，离心后取上清液经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种土鳖虫多糖，其特征在于由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为7.4∶3.1∶13.9∶9.3∶39.7∶26.5；相对分子量为2.14×10

【技术特征摘要】
1.一种土鳖虫多糖，其特征在于由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为7.4∶3.1∶13.9∶9.3∶39.7∶26.5；相对分子量为2.14×104Da；具有葡萄半乳聚糖主链结构，其重复单元的结构中主链由→4)-α-D-Glcp-(1→的葡萄糖和→3)-Galp-(1→的半乳糖组成，支链通过葡萄糖的O-6键、半乳糖的O-4键和O-6键连接在主链上，所述的主链单元结构及支链片段如下所示：
主链结构
支链1α-L-Araf-(1→
支链2Xylp-(1→4)-Xylp-(1→3)-Xylp-(1→
支链3α-L-Araf-(1→(5)-α-L-Araf-(1)3→
支链4支链5。


2.根据权利要求1所述的土鳖虫多糖，其特征在于含有吡喃糖环。


3.根据权利要求1所述的土鳖虫多糖，其特征在于该多糖通过以下方法制备：
(1)分离步骤：土鳖虫粉末经过水抽提、除蛋白、乙醇沉淀；
(2)纯化步骤：
①取经水提，Sevag试剂联合木瓜蛋白酶除蛋白，乙醇沉淀制得的土鳖虫多糖粗品，充分溶解于去离子水，用已平衡好的离子交换柱C...

【专利技术属性】
技术研发人员：周长林，沈雯，丁佳露，谢鑫，郭建，马菱蔓，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32