本发明专利技术公开了一种重组CL7‑CVN蛋白及其制备方法与应用。重组CL7‑CVN蛋白制备方法包括：将其编码序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达和纯化，得到重组CL7‑CVN蛋白。本发明专利技术通过合成的CVN基因和基因组装方法，构建了融合表达载体，实现其在大肠杆菌中的高效可溶性表达；根据重组CL7‑CVN蛋白的耐热性，通过热处理及3C蛋白酶酶切，可通过一步亲和层析快速得到重组CL7‑CVN蛋白和CVN蛋白，纯度可达99％。本发明专利技术提供的制备方法可使重组蛋白表达量显著提高、活性更稳定、纯化方法更简单；本发明专利技术制备的重组CL7‑CVN蛋白和CVN蛋白都具备抗病毒活性。
Recombinant cl7-cvn protein and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于重组基因蛋白药物
，具体涉及一种重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
蓝藻抗病毒蛋白(Cyanovirin-N，CVN)是一种从蓝藻中分离得到的一种水溶性糖蛋白，其独特的抗病毒活性最初是在一项抗人类免疫缺陷病毒(HIV)天然药物筛选计划中发现的，后来的研究表明其具有广泛的抗囊膜病毒作用，能抑制流感病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒和丙型肝炎病毒对宿主细胞的感染，同时具有稳定的理化特性，能抵抗变性剂、去垢剂和有机溶剂的处理。CVN与病毒表面糖蛋白上甘露寡糖有高亲合性，它能阻止宿主细胞表面受体与病毒的结合，阻止了病毒的传播，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，这使得CVN蛋白成为一种很有价值的抗病毒药物。CVN蛋白分子量11kDa，且分子中有2个二硫键，使得该蛋白在大肠杆菌中表达困难。早在CVN发现之初，CVN的重组表达研究就已经开始，目前已在大肠杆菌、酵母菌和植物细胞中表达成功，但这些重组表达方法存在表达产量低、易形成包涵体蛋白且复性困难、易形成无活性的二聚体形式、融合表达出现氨基酸缺失、纯化方法复杂等缺点。为了解决以上问题，本专利技术构建了CL7蛋白融合表达体系，这样以CL7融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞质中，以可溶形式高效表达，融合的重组CL7-CVN蛋白有完全生物学活性，表明重组CL7-CVN蛋白在胞质中能正确折叠，并且重组稳定性更好(100℃超过2h，鸡血清中半衰期超过30h)，避免了纯化时对重组蛋白进行变性、复性等复杂操作，同时为后处理带来方便，更适于放大生产。伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性，热性传染病。PRV主要感染猪，能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍，对养猪业危害极大。本专利技术进一步探讨了获得的重组CL7-CVN对伪狂犬病病毒的抗毒活性，结果表明，本专利技术提供的重组CL7-CVN具备作为抗伪狂犬病病毒药物的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组蓝藻抗病毒蛋白的编码序列，同时通过所述编码序列得到一种重组CL7-CVN蛋白，并进一步提供所述重组蓝藻抗病毒蛋白的应用，其技术方案如下：一种重组CL7-CVN蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。一种包含编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列的重组CL7-CVN蛋白表达载体。一种包含所述重组CL7-CVN蛋白表达载体的宿主细胞。一种重组CL7-CVN蛋白的制备方法，通过将编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，分离纯化，得到所述重组CL7-CVN蛋白。一种CVN蛋白的制备方法，通过将编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，分离纯化，得到所述CVN蛋白，所述分离纯化过程中包括用3C蛋白酶和3C酶切缓冲液洗涤并重悬镍柱的处理步骤。一种所述重组CL7-CVN蛋白和所述CVN蛋白在制备预防或治疗抗病毒耐热性药物中的应用，所述的病毒为伪狂犬病病毒或艾滋病毒。本专利技术提供的技术方案至少包括以下有益效果：1、本专利技术利用突变体CL7蛋白具有促进重组蛋白可溶性表达和热稳定性高的特点，将CVN的编码序列通过密码子优化合成CVN基因，结合突变体CL7基因，同时融合His和3C标签，通过分子设计及优化构建了CL7-linker-His-3C-CVN重组融合表达体系，并实现重组CL7-CVN蛋白在大肠杆菌中可溶性表达。2、利用表达重组CL7-CVN蛋白具备较高的热稳定性，通过水浴热处理简化对表达后重组CL7-CVN蛋白的纯化；同时融合His和3C标签，可以通过一步亲和纯化得到重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白，使得纯化效率更高，纯度高达99％。3、本专利技术制备的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白都具备抗伪狂犬病毒活性，处理浓度为0.5u-1uM时，抗病毒效果最好。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术提供的融合表达体系CL7-linker-His-3C-CVN结构示意图；图2为本专利技术提供的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白的制备流程图；图3为本专利技术提供的线性载体和目的基因片段PCR扩增结果电泳图(SDS-PAGE)：图中1、2泳道分别为原始载体pET28a、PCR扩增得到的线性载体pET28a；3、4泳道分别为PCR扩增得到CL7-linker-His、3C-CVN线性片段，M泳道为DL5000marker；图4为本专利技术提供的转化后大肠杆菌DH5a菌落的PCR鉴定结果电泳图(SDS-PAGE)：1泳道为原始载体PCR对照；2、3、4、5泳道分别为不同菌落的PCR鉴定结果；M泳道为DL5000marker；图5为本专利技术提供的转化后质粒鉴定结果电泳图(SDS-PAGE)：1泳道为PCR扩增得到的线性pET28a载体；2、3、4、5泳道分别为不同菌落的质粒鉴定结果；M泳道为DL5000marker；图6为本专利技术提供的37℃条件下pET28a、pET28a-CVN、pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN三种表达载体诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为pET28a诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为pET28a-CVN诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；图7为本专利技术提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN在不同温度条件下1mMIPTG诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为18℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为28℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为37℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；图8为本专利技术提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN不同浓度IPTG条件下18℃诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为0.25mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为0.5mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为1mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；图9为本专利技术提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN在18℃、1mM/LIPTG条件下诱导不同时间表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为诱导1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组CL7-CVN蛋白，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组CL7-CVN蛋白，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.根据权利要求1所述重组CL7-CVN蛋白，其特征在于，其编码的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.一种包含如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的重组CL7-CVN蛋白表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述重组CL7-CVN蛋白表达载体的宿主细胞。
5.一种如权利要求1-2所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，通过将如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列克隆到原始表达载体上，得到重组CL7-CVN蛋白表达载体；将所述重组CL7-CVN蛋白表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，分离纯化，得到所述重组CL7-CVN蛋白。
6.根据权利要求5所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白表达载体为pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN，其制备方法如下：
(1)第一PCR扩增：以pET23a-CL7质粒为模板，如SEQIDNO:6所示的F1，如SEQIDNO:7所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到CL7-linker-His线性片段；根据genebank公布的CVN基因序列，进行密码子优化设计合成CVN基因，并以构建的pET28a-CVN载体为模板，以如SEQIDNO:8所示的F2和如SEQIDNO:9所示的R2为引物，同时引入3C及末端同源序列，进行PCR扩增，得到3C-CVN线性片段；
(2)第二PCR扩增：以pET28a质粒为模板，如SEQIDNO:10所示的F3和如SEQIDNO:11所示的R3为引物进行载体PCR扩增获得pET28a载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：余晓岚，王斌，王飞，马立新，杨智，刘敏，高丹，陈冠军，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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