单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用。通过该方法成功挖掘到多种血清型特异性SNP。将不同血清型特异性SNP组合使用，通过将血清型特异性SNP置于引物的3′末端，使某种血清型高效扩增，而其他血清型扩增效率极低，达到区分出主要血清型的目的，另外，通过同时使用某一基因的两个SNP区域设计两个特异性引物，再设计一条共用引物，可以三条引物区分两种型，最大化节省引物的数量。因此，本发明专利技术从特异性碱基出发开发了一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的方法，且相比现有的多重PCR方法实现了引物用量的减少，且准确率较高，与Doumith的方法对比，对60株单增李斯特分型一致性达100％。

Mining method and application of serotype specific SNP of Listeria monocytogenes

【技术实现步骤摘要】
单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用
本专利技术属于致病微生物血清型鉴定检测领域，涉及一种以血清型特异性SNP为基础开发的多重PCR检测单增李斯特主要血清型的方法，具体涉及一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法及其应用。
技术介绍
单增李斯特菌是一种人畜共患致病菌，常引起严重的食品安全问题，人类受感染后可造成脑膜炎、败血症、流产等症状，对老人、孕妇、儿童等免疫低下者会造成严重的后果，致死率达20％～30％(参考文献：RadoshevichL,CossartP.Listeriamonocytogenes:towardsacompletepictureofitsphysiologyandpathogenesis.NatureReviewsMicrobiology.2018,16(1):32-46)。该菌抗逆性较强，可在低温(4℃)、高盐环境下生长，常在鸡肉、鱼肉、牛肉等食品中分离到该菌，是重点监控的食源性致病菌。近几年随着我国饮食结构的变化，生食、快餐的大规模食用也会增加单增李斯特菌的爆发风险，对单增李斯特菌的溯源、监控也变得尤为重要。截止目前，单增李斯特菌共检测到13种血清型，其中1/2a、1/2b、1/2c、4b型是最常见的四种型，从临床和食品中分离的单增李斯特菌中该四种型占到95％以上。传统的血清型鉴定方法是针对菌体表面的O抗原和H抗原的差异，采用血清分型试剂盒进行鉴定，该方法费时费力且价格昂贵。基于PCR的分子分型方法快速、廉价、高通量可弥补血清试剂盒分型的不足，现阶段已有许多关于单增李斯特菌血清分型的分子分型方法，多是通过筛选血清型特异性基因，采用PCR的方法实现对单增李斯特的血清分型。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法。通过该方法成功挖掘到多种血清型特异性SNP(单核苷酸多态性，SingleNucleotidePolymorphism)。将不同血清型特异性SNP组合使用，用等位基因特异性多重PCR的方法，达到区分出主要血清型的目的，并且可最大化节省引物的数量。通过将血清型特异性SNP置于引物的3′末端，使某种血清型高效扩增，而其他血清型扩增效率极低，从而实现血清分型的目的，另外，通过同时使用某一基因的两个SNP区域设计两个特异性引物，再设计一条共用引物，可以三条引物区分两种型，最大化节省引物的使用量。本专利技术的另一目的在于提供一种用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组。本专利技术的另一目的在于提供一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供上述引物组或试剂盒的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种用于鉴定单增李斯特菌主要血清型的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法，包括如下步骤：(1)首先从NCBI的biosample模块下载已知血清型的单增李斯特菌基因组207个，所有下载的基因组均为fasta格式，在每个基因组信息中标注血清型和编号，然后将所有207个基因组写入到一个fasta格式的文件，称为genemos；所述的已知血清型的单增李斯特菌基因组207个包括77个1/2a型，3个3a型，6个1/2c型，1个3c，58个1/2b型，1个3b型，1个7型，57个4b型，2个4a，1个4c；(2)以单增李斯特标准菌株EGD-e的全部CDS与genemos做本地blast(blastn，e<10-200)，并以outform-6形式输出，输出文件的第二列为带有血清型标签和编号的基因组名，第五列为不匹配碱基数，blastn的结果会依照序列匹配度由高到低排列，结合该两列信息初步筛选含有某种类型SNP的备选基因；(3)以备选基因序列与genemos做本地blast(blastn，e<10-200)，以blastn的默认格式输出，输出结果包含了备选基因在所有含有该备选基因的基因组中的序列，将所有基因组中匹配上的条带完整截取下来，并与基因组名一一对应，以fasta格式按照blastn输出结果的顺序将所有序列一并写入到文件a中；(4)用MEGA软件打开文件a，MEGA软件会以四种不同的颜色显示A、T、C、G四种碱基，结合血清型标签及编号，即可找到血清型特异性SNP及碱基类型。考虑到来自基因库的基因组血清型并非完全准确，仅灵敏度及特异性超过85％的SNP位点作为备选靶点。用此方法筛选其他物种其他类型的SNP，也在本权利保护范围内。所述的血清型包括1/2b、3b、7、4b、4d、1/2a、3a、1/2c、3c、4a、4c；其中，1/2b、3b、7、4b、4d为血清族Ⅰ，1/2a、3a、1/2c、3c为血清族Ⅱ，4a、4c为血清族Ⅲ。表1具有分型潜力的备选靶点注：下划线标注的碱基为多重PCR中使用的SNP位点。其中，483(A)SNP位点在Lmo1076基因中第483位，A类型碱基是1/2c-3c血清型保守且特异的碱基类型。其他同理。所选用的多重PCR分型靶点及SNP位点：由于单增李斯特菌基因组的整体GC含量较低(低于40％)，很多SNP位点不适合设计引物，需挑选适合设计引物的位点用于多重PCR分型。引物设计原则：根据上述所挖掘的特异性SNP，选择含有两种类型SNP的基因，尽可能选择含有连续多个SNP的区域，将SNP位点区域置于引物3′末端，其中引物3′末端必须为特异性碱基，设计两个特异性引物，再设计一个共用正向或反向引物；如果所设计的特异性引物为正向引物，则设计一个共用反向引物，如果特异性引物为反向引物，则设计一个共用正向引物，共用反向引物或共用正向引物序列要求高度保守，不含SNP位点；所有引物要求GC含量适中，不能含有连续超过四个G/C或A/T，如此即可以3条引物分出两种血清型，若含有多种血清型的SNP，也可以此法分出多种血清型，可最大化节省引物数量。用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组，包括：(1)扩增单增李斯特菌的特异性基因的引物对；(2)扩增血清族Ⅰ和Ⅱ所共有基因的SNP位点的特异性引物组；其中，所述的血清族Ⅰ和Ⅱ所共有基因含有多个血清族Ⅰ和Ⅱ差异碱基，且在同一血清族中碱基类型高度保守；所述特异性引物组包括血清族Ⅰ引物F-Lm1、血清族Ⅱ引物F-Lm2和共用下游反向引物R-1-2；(3)扩增基因中含有一个1/2c-3c型SNP且含多个1/2b-3b-7型SNP的特异性引物组；所述特异性引物组包括血清型1/2c-3c引物R-1/2c，血清型1/2b引物R-1/2b和共用上游正向引物F-c-b；优选的，步骤(1)中所述的单增李斯特菌的特异性基因为prfA基因；该prfA基因参考自文献(RossmanithP,KrassnigM,WagnerMetal.DetectionofListeriamonocytogenesinf本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)首先从NCBI的biosample模块下载已知血清型的单增李斯特菌基因组207个，所有下载的基因组均为fasta格式，在每个基因组信息中标注血清型和编号，然后将所有207个基因组写入到一个fasta格式的文件，称为genemos；/n所述的已知血清型的单增李斯特菌基因组207个包括77个1/2a型，3个3a型，6个1/2c型，1个3c，58个1/2b型，1个3b型，1个7型，57个4b型，2个4a，1个4c；/n(2)以单增李斯特标准菌株EGD-e的全部CDS与genemos做本地blast，即调用blastn，参数为e<10

【技术特征摘要】
1.一种单增李斯特菌血清型特异性SNP的挖掘方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)首先从NCBI的biosample模块下载已知血清型的单增李斯特菌基因组207个，所有下载的基因组均为fasta格式，在每个基因组信息中标注血清型和编号，然后将所有207个基因组写入到一个fasta格式的文件，称为genemos；
所述的已知血清型的单增李斯特菌基因组207个包括77个1/2a型，3个3a型，6个1/2c型，1个3c，58个1/2b型，1个3b型，1个7型，57个4b型，2个4a，1个4c；
(2)以单增李斯特标准菌株EGD-e的全部CDS与genemos做本地blast，即调用blastn，参数为e<10-200，并以outform-6形式输出，输出文件的第二列为带有血清型标签和编号的基因组名，第五列为不匹配碱基数，blastn的结果会依照序列匹配度由高到低排列，结合该两列信息初步筛选含有某种类型SNP的备选基因；
(3)以备选基因序列与genemos做本地blast，即调用blastn，参数为e<10-200，以blastn的默认格式输出，输出结果包含了备选基因在所有含有该备选基因的基因组中的序列，将所有基因组中匹配上的条带完整截取下来，并与基因组名一一对应，以fasta格式按照blastn输出结果的顺序将所有序列一并写入到文件a中；
(4)用MEGA软件打开文件a，MEGA软件会以四种不同的颜色显示A、T、C、G四种碱基，结合血清型标签及编号，即能找到血清型特异性SNP及碱基类型；
其中，考虑到来自基因库的基因组血清型并非完全准确，仅灵敏度及特异性超过85％的SNP位点作为备选靶点。


2.单增李斯特菌血清型特异性SNP，其特征在于：所述SNP如表1所示：
表1具有分型潜力的备选靶点











3.用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组，其特征在于包括：
(1)扩增单增李斯特菌的特异性基因的引物对；
(2)扩增血清族Ⅰ和Ⅱ所共有基因的SNP位点的特异性引物组；其中，所述的血清族Ⅰ和Ⅱ所共有基因含有多个血清族Ⅰ和Ⅱ差异碱基，且在同一血清族中碱基类型高度保守；所述特异性引物组包括血清族Ⅰ引物F-Lm1、血清族Ⅱ引物F-Lm2和共用下游反向引物R-1-2；
(3)扩增基因中含有一个1/2c-3c型SNP且含多个1/2b-3b-7型SNP的特异性引物组；所述特异性引物组包括血清型1/2c-3c引物R-1/2c，血清型1/2b引物R-1/2b和共用上游正向引物F-c-b。


4.根据权利要求3所述的用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组，其特征在于：步骤(1)中所述的单增李斯特菌的特异性基因为prfA基因；
步骤(2)中所述的血清族Ⅰ和Ⅱ所共有基因为Lmo1441、Lmo2772、Lmo2672、Lmo2043、Lmo0897或Lmo0948；
步骤(3)中所述的基因为Lmo1076、Lmo1078或Lmo1188。


5.根据权利要求3或4所述的用于单增李斯特菌血清型多重PCR分型的引物组，其特征在于：
(1)单增李斯特菌的特异性基因的引物对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，张旭，马毅，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44