一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用，材料包括：人造纳米纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料。本发明专利技术复合纳米纤维材料，既保留了左旋聚乳酸传统生物医用材料的无毒、可降解等优点，又提高了支架材料的柔韧性和抗拉伸强度等力学性能；由于细胞外基质在不同物种间具有高度保守性，脱细胞来源的细胞外基质支架具有低免疫原性和优异的生物相容性等优点，可以接种从拟置入患者体内获得的并扩增的间质干细跑，经适当培养即可形成用于植入人体替代缺损组织的组织工程假体支架。

Preparation and application of a biomimetic composite nanofiber scaffold material

【技术实现步骤摘要】
一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用
本专利技术属于组织工程材料及其制备和应用领域，特别涉及一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用。
技术介绍
骨损伤是近年来急剧增加的临床案例，但机体自我修复功能有限，一般对于直径超过2mm的缺损，其愈合能力大大降低。因此，组织工程诞生之际，也带来了彻底治愈骨损伤的希望。1987年美国国家科学基金委员会首认了组织工程技术，其三要素包括种子细胞、支架和生物活性因子。其中，尤为关键的是制备一种能够模拟体内微环境的支架，理想的支架不单单只是为种子细胞提供附着的场所，而且还要能够更好的促进种子细胞的增殖与分化。现有的支架材料主要包括人工合成的高分子聚合材料(如左旋聚乳酸PLLA,聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA,聚己内酯PCL)和天然生物大分子材料，如丝素蛋白(silkfibroin,SF)和壳聚糖(chitosan,CTS)。人工合成的高分子聚合材料可降解并具有一定的机械性能，但亲水性差且降解后的酸性产物不利于种子细胞的存活。天然生物大分子材料具有良好的亲水性、可塑性和柔韧性，且降解产物对细胞无毒害作用，但机械性能差。近年来研究发现：将天然生物大分子材料与人工合成的高分子聚合材料结合，使其优势互补，所制备的复合支架能够较好地作为仿生替代材料。然而，人体组织结构复杂，目前的工程技术尚不能构建完美模拟体内微环境的组织，故而限制了组织工程的临床转化应用。因此，众多学者开始将研究方向转向细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)。该研究出现于上世纪九十年代初，其原理是通过脱组织或细胞技术制备去细胞结构的细胞外基质用于皮肤、骨等组织再生，从而降低异体组织或细胞移植的免疫原性。细胞外基质不仅留有组织或器官中主要的蛋白成分，包括结构和功能蛋白(如胶原和弹性蛋白),还有多糖组分(如蛋白聚糖和糖胺聚糖)，这些活性成分的保留有利于促进种子细胞与支架材料的结合，增强细胞的粘附，提高生物相容性。同时，制备的活性细胞外基质还可以将组织或细胞的超微结构保存完整，其中富含有多种生长因子(如bFGF、EGF等)能够促进种子细胞的增殖与分化。目前，CN105194734A公开了一种壳聚糖-细胞外基质组织修复膜及其制备方法，但价格昂贵，而一般的壳聚糖含杂质较多，易引起感染；此外，CN105194734A专利技术材料中的细胞外基质经与壳聚糖混合再烘干，可能会造成细胞外基质的生物活性降低。本专利技术采用静电纺丝技术制备的纳米纺丝膜可以很好的模拟细胞外基质，之后脱细胞留下的细胞外基质未进行蛋白质破环性的操作，赋予了支架良好的生物活性，并为支架提供适当的机械性能。PLLA和丝素物美价廉，适于规模化生产和临床应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用，克服现有技术仿生骨支架无法同时满足良好机械性能和生物相容性的缺陷。本专利技术中用人造高分子纤维支架材料作为基础材料，在此基础材料纤维结构的表面复合由动物细胞来源的细胞外基质材料，由此组成一种在后期为制作组织工程假体而接种组织细胞时更加有利于细胞存活及生长的纳米级尺寸结构的组织工程复合纤维支架材料。本专利技术将左旋聚乳酸/丝素蛋白两种材料混合进行静电纺丝，灭菌后将细胞种植在上面，再通过化学方法进行脱细胞，从而获得负载着细胞外基质的纳米纤维支架。本专利技术一种复合纤维支架材料，所述材料包括人造高分子纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料，不同类型细胞进行脱细胞后留下的细胞外基质材料包覆在基于人造高分子纤维支架材料制成的纤维结构(左旋聚乳酸/丝素蛋白混合材料静电纺丝支架)的外表面；所述的人造高分子纤维支架材料包括人工合成的高分子聚合材料和天然生物大分子材料。进一步，所述人造高分子纤维支架材料为静电纺丝纳米纤维支架材料。进一步的优化，所述的细胞外基质材料由已分化成熟的功能组织细胞合成。更进一步的优化，所述的细胞外基质材料由接种在人造高分子纤维支架材料内的已分化成熟的异体动物功能组织细胞原位合成。所述的功能组织细胞包括同种异体组织细胞和异种异体组织细胞。再进一步地优化，所述的已分化成熟的异体动物功能组织细胞为成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞。所述高分子纤维支架材料为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；细胞外基质材料为大鼠成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞的外层基质材料。本专利技术的一种复合纤维支架材料的制备方法，包括：(1)将高分子纤维支架进行灭菌，清洗，加入培养基中进行预培养；(2)将细胞种植在步骤(1)支架上，待细胞贴壁后固定细胞，然后脱细胞，即得。所述步骤(1)中高分子纤维支架为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；其中左旋聚乳酸与丝素蛋白的质量比为3:7～7:3。所述左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的具体制备方法为：将左旋聚乳酸(MW＝100,000g/mol)与丝素蛋白以适当质量比混溶于HFIP(六氟异丙醇)中，配置纺丝液，进行静电纺丝；电纺后的纳米材料置于真空干燥箱中3天以上充分干燥。所述步骤(1)中灭菌具体为：采用乙醇或甲醇处理纳米纤维支架，然后紫外照射灭菌。所述步骤(2)中细胞为猪成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞。所述步骤(2)中固定细胞为4％(w/v)多聚甲醛固定细胞；脱细胞为：用TritonX-100处理细胞，清洗。复合纤维支架材料的制备方法具体为：a.丝素蛋白的提取：蚕茧去除杂质后，置于Na2CO3水溶液中煮沸，进行脱胶；将脱胶蚕丝水分拧干、拉松铺展在铝箔上烘干；将干燥后的蚕丝溶于三元体系CaCl2/CH3CH2OH/H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中，加热搅拌；将溶解液常温透析，获得丝素蛋白溶液，过滤，冷冻干燥后获得纯丝素蛋白。b.左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的制备：将左旋聚乳酸与丝素蛋白按100/0,70/30,50/50,30/70,0/100的质量比分别混溶于HFIP(六氟异丙醇)中，配置纺丝液，进行静电纺丝；电纺后的纳米材料置于真空干燥箱中3天以上充分干燥。c.复合纳米纤维支架的灭菌：将材料放入培养板中，用体积比为90％的甲醇或者乙醇处理10-15min，使丝素蛋白结构改变；吸弃甲醇，加入无水乙醇浸泡过夜；吸弃乙醇后，紫外照射2h以上，再用75％乙醇浸泡2h以上；吸弃乙醇，用PBS清洗；每孔加入培养基置于培养箱进行预培养。d.成骨细胞的提取：取出生一天的SD大鼠浸泡于75％酒精中；取出置于无菌板上，用眼科剪剪取颅骨，剔除其他组织，置于PBS中清洗，该操作在冰上进行；将颅骨剪碎，加入胰酶，置于细胞培养箱中消化30-40min；加入2倍体积的培养基终止消化，离心，加入培养基于培养箱中培养；隔天换液，待细胞覆盖率达80％左右进行传代。e.成骨细胞外基质的负载：将成骨细胞种植于上述灭菌支架上；待细胞贴壁后，用新鲜配置的4％(w/v)多聚甲醛固定细胞；再用TritonX-100处理细胞；PBS清洗后，该复合纳米纤维支架即制备而成。本专利技术的一种所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复合纤维支架材料，其特征在于，所述材料包括人造高分子纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料，且所说的细胞外基质材料包覆在由所说的人造高分子纤维支架材料制成的纤维结构的外表面。/n

【技术特征摘要】
1.一种复合纤维支架材料，其特征在于，所述材料包括人造高分子纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料，且所说的细胞外基质材料包覆在由所说的人造高分子纤维支架材料制成的纤维结构的外表面。


2.根据权利要求1所述支架材料，其特征在于，所述高分子纤维支架材料为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；细胞外基质材料为大鼠成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞的外层基质材料。


3.一种复合纤维支架材料的制备方法，包括：
(1)将高分子纤维支架进行灭菌，清洗，加入培养基中进行预培养；
(2)将细胞种植在步骤(1)支架上，待细胞贴壁后固定细胞，然后脱细胞，即得。


4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中高分子纤维支架为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；其中左旋聚乳酸与...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄向新，刘红梅，吴云亮，李月霞，周磊，宋滇文，张传忠，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31