一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种可检测SNP的新型LAMP方法，包括以下步骤：(1)提取DNA为待检测模板；(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。相应的，本发明专利技术还公开了基于上述方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒。本发明专利技术的检测方法具有特异性强和灵敏度高的优点。

A new lamp method, primer set and kit for SNP detection

【技术实现步骤摘要】
一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种可检测SNP的新型LAMP方法、引物组和试剂盒。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，与许多疾病直接相关。对于SNP的检测分析在新药研究、用药探讨、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。目前已有报道的SNP检测技术包括高通量测序技术、毛细管电泳技术，流式荧光杂交、变性高效液相色谱检测、等位基因特异寡核苷酸片段分析，焦磷酸测序技术、ARMS-技术和HRM技术等，这些方法在SNP检测中要么检测周期长、要么灵敏度低、要么特异性不够强、要么成本高操作复杂，要么容易造成污染，因此亟需专利技术一种能更好地客服主流方法缺陷的SNP检测方法。环介导等温扩增(LAMP)技术针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst酶)，在恒温条件下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。与传统分离鉴定相比，具有周期短、敏感性强，特异性高的优点。LAMP引物组一般由内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，外引物F3和B3以及环引物LoopF/LoopB组成。环引物是设计在F1c和F2之间或者B1c和B2之间的引物，其主要是在LAMP正常延伸反应启动的前提下，起到大大提高等温扩增效率的作用。然而，最初的LAMP技术仅能扩增一定的基因片段而无法实现对SNP的检测。鸡白痢沙门菌(SalmonellaPullorum)属于肠道杆菌科沙门氏菌属的成员，其与鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌都属于沙门菌D血清组。鸡白痢沙门菌造成的鸡白痢病是一种严重的系统性疾病，能垂直传播，临床症状是体重减轻，产卵减少和生殖能力受损，严重影响蛋鸡生产，感染2～3周龄的小鸡时造成很高的死亡率；鸡伤寒沙门菌造成的禽伤寒病对任何年龄的禽类都有影响，主要在成年鸡中观察到，可垂直传播，主要临床症状是进食量突然减少，嗜睡，发烧，黄绿色腹泻，很快死亡。肠炎沙门氏菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌，感染后的典型症状包括发热、腹泻和呕吐；在临床生产中三者有时往往难以区分。国务院提出2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准，但目前部分场净化效果还不太理想。鸡白痢沙门菌的早期快速检测鉴别是该病防控和净化的基础。传统的分离鉴定方法周期长，经历预增菌、选择性增菌、生化鉴定、运动型检查、血清学鉴定等流程。而玻片凝集试验容易产生非特异性反应并且缺乏敏感性。因为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鸡肠炎沙门菌都属于D血清群，具有非常相似的抗原表达式，在玻片凝集试验中纯粹依靠抗原表达式往往发生误判。因此，在目前国内养殖场提倡净化鸡白痢的大环境下，专利技术一种效率高、特异性强、敏感性高的鸡白痢沙门菌检测方法具有重要的公共卫生学意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种可检测SNP的新型LAMP方法，具有特异性强、敏感性高的特点。本专利技术的目的在于提出基于一种可检测SNP的新型LAMP方法用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒，具有准确快速检测出鸡白痢沙门菌的特点。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一种可检测SNP的新型LAMP方法，包括以下步骤：(1)提取DNA为待检测模板；(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。进一步的，环引物探针由荧光基团和淬灭基团修饰；反应体系中包含RnaseHⅡ酶，当环引物探针与DNA突变位点结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使荧光基团和淬灭基团分离。进一步的，内引物为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP；外引物为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3。进一步的，反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、环引物探针、内引物和外引物。进一步的，反应体系的反应温度为58℃-62℃。基于上述检测方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，包括：正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；正向内侧引物FIP的核苷酸序列：5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；反向内侧引物BIP的核苷酸序列：5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；环引物探针的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA碱基)TCTAT-Eclipse-3′；引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。基于上述检测方法的检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，包括反应液，反应液包括环引物探针、正向内侧引物FIP、反向内侧引物BIP、正向外侧引物F3和反向外侧引物B3；正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；正向内侧引物FIP的核苷酸序列：5′-GTCTTCCATAGCAAGCAATAGTGTTCACGACAGAAAATAATTGGATCG-3′；反向内侧引物BIP的核苷酸序列：5′-ACCTGCAACAGCTTTAATAGAAAGCGAATACTGCATCAAGTGATGAG-3′；环引物探针的核苷酸序列：5′-CAGAGTATT(FAM)AGAG(RNA碱基)TCTAT-Eclipse-3′；引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。进一步的，反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP：2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、环引物探针0.5μl、FIP+BIP4μl和F3+B30.5μl。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术根据该新型LAMP扩增法则提出了基于环引物探针-单核苷酸互补激活酶切割的环介导等温扩增方法用于SNP检测。该检测方法的原理是靶向含有SNP的待检基因，设计一条荧光基团修饰的环引物探针。在该探针相应位点设计可与DNA突变位点相结合的RNA碱基，当两者特异互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号；当不发生特异结合时不产生荧光信号。基于单核苷酸互补激活酶切割产生荧光信号的原理具有非常好的特异性，能完成对SNP的特异检出，同时具有很本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取DNA为待检测模板；/n(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，所述环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；/n(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取DNA为待检测模板；
(2)设计荧光基团修饰的环引物探针、内引物和外引物，所述环引物探针具有与DNA突变位点相结合的RNA碱基；
(3)建立反应体系，将待检测模板加入到反应体系中，检测反应物是否产生荧光信号，若产生荧光信号则表示待检测模板中具有目标DNA，若未产生荧光信号则表示待检测模板中无目标DNA。


2.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述环引物探针由荧光基团和淬灭基团修饰；
所述反应体系中包含RnaseHⅡ酶，当环引物探针与DNA突变位点结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使荧光基团和淬灭基团分离。


3.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述内引物为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP；所述外引物为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3。


4.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、环引物探针、内引物和外引物。


5.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法，其特征在于，所述反应体系的反应温度为58℃-62℃。


6.基于权利要求1所述的可检测SNP的新型LAMP方法用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，其特征在于，包括：
正向外侧引物F3的核苷酸序列：5′-AGGAACAATGAAGCTACCATA-3′；
反向外侧引物B3的核苷酸序列：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；
正向内侧引物FIP的核苷酸序列：
5′-GTCTTCCATAGCAAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建民，温俊平，廖明，张红霞，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44