一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法，所述Cpf1试剂盒包括用于Cpf1检测体系；所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4的特异性crRNA、Cpf1蛋白和单链DNA报告系统；所述特异性crRNA为针对突变位点设计合成的任意一种或多种；所述单链DNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter。本发明专利技术系首次采用Cpf1检测SLC26A4基因突变位点，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及遗传性耳聋的基因检测领域，特别是涉及一种针对临床诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征中应用的SLC26A4基因多个突变位点的快速检测方法及检测试剂盒，属于生物

技术介绍
耳聋是临床上常见的听力神经系统缺陷疾病，严重影响人类的生活质量，导致耳聋发生的原因有多种，遗传因素和环境因素以及药物、创伤、感染等都会导致耳聋的发生。全球新生儿耳聋的发病率约为1/1000，其中50％以上是由遗传因素引起的。在遗传性耳聋，约80％是常染色体隐性遗传，虽然耳聋基因具有较高的基因和位点异质性，但大部分遗传性耳聋多由少数几个热点基因突变引起，包括GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体12SrRNA基因等，这使得遗传性耳聋的筛查成为可能。大前庭水管综合症是非综合症型相关的常染色体隐性遗传疾病，和pendred综合征具有相同的致病基因。在1997年Everett首先报道SLC26A4基因为前庭导水管扩大/pendred综合征的致病基因。SLC26A4基因位于常染色体7q31区域，含有21个外显子，开放阅读框为2343bp，其编码含有780个氨基酸残基的多次跨膜蛋白Pendrin，该蛋白主要有疏水氨基酸组成，属于阴离子转运家族SLC26A中的一员，主要是介导Cl-，HCO3-，OH-等阴离子的转运。在内耳，Pendrin蛋白可能能够通过调节Cl-的转运来维持淋巴液的离子平衡，还有研究发现Pendrin蛋白参与协调内耳的发育。目前已发现SLC26A4基因上百个突变位点与耳聋发生相关，且突变谱和不同位点的突变频率在不同人群中差异较大，在中国，最常见的SLC26A4基因的突变位点为IVS7-2A>G和c.2168A>G等。这种与SLC26A4基因突变相关的耳聋临床表现为先天性感音神经性或混合型耳聋，有时呈波动性或渐进性，其波动性常与感冒或头部外伤相关，或伴有眩晕发生。当前针对耳聋尚无治疗方法，只能通过孕前耳聋基因热点突变的携带者筛查，孕期无创和侵入性产前诊断以及产后基因检测的方法，建立遗传性耳聋的三级预防干预措施。目前，对于耳聋的检测技术有很多，主要有等位基因特异性PCR，微列阵基因芯片以及核酸质谱和测序技术等，这些技术或检测通量高，或准确定高，但不足之处在于检测样本主要来源是成人静脉血或新生儿足跟血，是侵入性取样，并且样品制备过程操作繁琐，检测时间较长，测序成本高，数据分析难度较大，基于这些技术开发的灵敏度高，特异性高且快速便捷的无创检测较少。CRISPR-Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas9蛋白家族已被广泛应用到基因编辑、抗病毒制剂和生物影像等众多领域。CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPRRNA(crRNA)成熟，并产生具有交错5'的PAM远端dsDNA断裂和3'端不通顺。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式切割双链DNA(dsDNA)时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于Cpf1上述特性，我们开发了一种快速准确的检测方法，用于检测临床标本中遗传性耳聋的突变位点。从待检临床样品中提取基因组dsDNA，并在等温条件下进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。Cpf1-crRNA复合物结合并切割靶标SLC26A4dsDNA，其激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测遗传性疾病的遗传突变提供了强有力的平台。胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、可以长期稳定保存以及相对低成本，这些特性使其广泛适用临床上针对耳聋基因SLC26A4突变位点的高特异性，高灵敏度，方便快捷的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对临床遗传性耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征致病基因SLC26A4突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T的快速检测，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的耳聋检测的Cpf1试剂盒及其检测方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于遗传性耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征致病基因SLC26A4多个位点的快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于前庭导水管扩大/pendred综合征多个致病位点突变的Cpf1检测体系。所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4基因部分突变位点的特异性crRNA和对照crRNA，Cpf1蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。所述特异性crRNA为针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T设计的任意一种或多种crRNA，其序列见文中表2，4，5，6和7(或SEQNO.9到SEQNO.38)。所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNAFQreporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNADBreporter；其中，所述ssDNAFQreporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNAFQreporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNADBreporter为利用地高辛(Digoxin)和生物素(Biotin)标记的ssDNA,标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNADBreporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。优选地，上述用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒还进一步包括免疫胶体金试纸条；所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。优选地，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对SLC26A4基因的多个突变位点IVS7-2A>G，c.1174A>T，c.1229>T，c.2168A>G，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T的Cpf1检测体系；/n所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4基因的多个位点的特异性crRNA和对照crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统；/n所述特异性crRNA为针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T设计的任意一种或多种crRNA，其序列为SEQ NO.9到SEQ NO.38；/n所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQreporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为利用地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T的Cpf1检测体系；
所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4基因的多个位点的特异性crRNA和对照crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统；
所述特异性crRNA为针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T设计的任意一种或多种crRNA，其序列为SEQNO.9到SEQNO.38；
所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNAFQreporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNADBreporter；其中，所述ssDNAFQreporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNAFQreporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNADBreporter为利用地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNADBreporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。


2.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，还包括免疫胶体金试纸条；
所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。


3.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，优化了Cpf1检测体系以更好的区分正常位点及突变位点：针对SLC26A4基因突变位点c.1229C>T和c.1174A>T，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，分别设计17nt，19nt，21nt，23nt长度的crRNA，以检测crRNA长度对区分正常位点及突变位点的影响；针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G和c.2168A>G位...

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，王鑫杰，金敏，张璐，金孝华，
申请(专利权)人：国家卫生健康委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11