一种改善线粒体功能的粘红酵母去乙酰化酶蛋白4的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改善线粒体功能的sirtuin4蛋白的应用及阐述其作用机制，属于生物技术领域。本发明专利技术将具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因在哺乳动物细胞中重组表达。实验结果表明其可以激活受损线粒体自噬的相关蛋白，显著降低哺乳动物细胞的SA‑β‑gal活性水平，增强CK19、β1整合素的表达水平，降低细胞内ROS水平水平，明显提升细胞内ATP水平，改善线粒体形态，从而改善了线粒体网络和提高了细胞抵抗衰老的能力，为使用sirtuin4蛋白治疗线粒体功能障碍和预防衰老提供了新的策略。

【技术实现步骤摘要】
一种改善线粒体功能的粘红酵母去乙酰化酶蛋白4的应用
本专利技术属菌种蛋白应用机制的生物
更具体地说，本专利技术涉及一种由哺乳动物细胞表达的粘红酵母sirtuin4蛋白的机制及其应用，其具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型的功能。
技术介绍
低等真核生物Sirtuin基因与寿命有关的证据为哺乳动物Sirtuins基因影响哺乳动物寿命提供依据。多种实验已经证明SIRT1可以用来抗衰老。最近研究显示脑特异性SIRT1过表达能够延长老鼠的寿命和延缓衰老。缺失SIRT1的近交小鼠胚胎发育和产后生活受损严重。最近的一项研究证实，缺失SIRT1的远交小鼠并不能通过能量限制延长寿命。这表明内源性SIRT1是CR触发的寿命效应所必须的。SIRT2对寿命的影响尚未明确，但SIRT2可能可以预防某些与衰老相关的疾病。SIRT3是Sirtuin家族中第一个发现与哺乳动物衰老有联系的蛋白，一系列的研究报道了SIRT3作为线粒体重要的去乙酰化酶在维持线粒体功能中发挥重要作用。SIRT通过对对听力损伤的保护达到在CR下的抗衰老。此外，SIRT3能够调节ROS水平。迄今为止，还没有研究指出SIRT4或SIRT5基因与抗衰老之间的联系，但SIRT4和SIRT5调节线粒体代谢的潜在作用，不难联想到这些Sirtuins在衰老相关疾病中的潜在影响。线粒体动力学失调和线粒体形态异常是衰老的标志，被认为是造成许多年龄相关病变的病理学原因。线粒体活力与线粒体质量控制有关，是非对称的裂变和融合的过程。重构线粒体网络促进线粒体和其他细胞器的相互作用，维持线粒体的代谢活性。Sirtuins可通过多条通路调控线粒体功能，Sir2是否直接通过对线粒体功能的调控实现机体抗衰老还未知，以及如何控制线粒体网络以实现抗衰老是需要研究的。衰老与线粒体网络稳态的丧失有关，但是与这些变化相关的生物衰老的细胞过程仍不清楚。通过融合和裂变的线粒体网络的动态重构促进了细胞稳态的维持。线粒体动力学失调和线粒体形态异常是衰老的标志，被认为是造成许多年龄相关病变的病理学原因。线粒体一直处于不断融合和分裂的循环中，这是两个完全相反的过程，对维持线粒体的数量和质量、以及线粒体之间物质交换至关重要，另外，正常的线粒体膜电位是融合和裂变所必须的。线粒体分裂增加线粒体数量，线粒体融合完成线粒体间蛋白质互补和信息传递。随着年龄增长，细胞内积累过多的线粒体碎片，诱导疾病的发生。线粒体融合和分裂需要相关蛋白质的参与和调控。功能正常的线粒体在与另一线粒体融合的过程需要定位在外膜的融合蛋白Mfnl、Mfn2和定位在内膜的视神经萎缩因子(OPA1)的参与。特别的是，线粒体分裂是一个非选择性过程，需要动力相关蛋白1(Drpl)、Fisl、MFF和MTP18的参与。一组4698个可行的单基因缺失菌株进行了酵母RLS的系统分析，并鉴定了238个的单基因缺失延长寿命，提示单基因也能影响寿命。值得注意的是，敲除酿酒酵母的去乙酰化酶基因，包括SIR2,3,4，HDA1,2,3，HOS1,2,3,4，HST1,2,3,4，RPd3,SAP1,30,155,185,190，4，并不能延长寿命，说明这些基因是维持细胞活性所必需的，可能与细胞抗衰老有关。粘红酵母是已知的脂质生产者，细胞的形态变化伴随着增殖和分化，生长良好时形成大量的脂滴，细胞衰老时产油量减少，而且比酵母细胞生长期更容易被观察到，是一个很好的研究模型。经NCBI上检索发现，粘红酵母含有五个Sir2同源基因：hst3,hst4,sirtuin1,sirtuin2,sirtuin4。酵母Sir2家族与人的Sirtuins高度同源。因此探讨酵母Sir4是否具有逆转细胞衰老表型的作用，并研究这一过程中线粒体分裂与融合、线粒体自噬以及线粒体动力学的改变对细胞活性和衰老的影响；进一步在在哺乳动物中验证。这项研究为用于预防和治疗抗衰老或代谢综合征等线粒体功能障碍的疾病提供新策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种粘红酵母sirtuin4蛋白的应用和阐述其作用机制。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：1.质粒的构建转染与细胞处理1.1质粒的构建1.2H2O2处理转染前后的HaCaT细胞1.3质粒转染1.4目的蛋白的鉴定2.细胞增殖能力测定（MTT法）2.1SA-β-gal活性测定2.2检测细胞CK19，β1整合素，CK10蛋白表达水平2.3WesternBlot技术检测蛋白表达水平2.4RT-PCR技术检测mRNA水平3.线粒体质量分析3.1透射电镜分析线粒体超微结构3.2Mito-Tracker分析线粒体形态3.3线粒体动力学蛋白及自噬蛋白表达水平3.4WesternBlot技术检测线粒体融合分裂蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1，自噬相关蛋白的表达水平3.5RT-PCR技术检测自噬相关蛋白mRNA表达水平3.6DCFH-DA探针检测胞内ROS含量3.7处理后HaCaT细胞的ATP及酶的水平3.8ATP试剂盒测定ATP水平变化测定3.9试剂盒测定SOD、CAT、ATP合成酶水平本专利技术公开了一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因及其作用机制，属于生物
本专利技术将具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因在人HaCat细胞中重组表达。实验结果表明其可以激活受损线粒体相关蛋白，降低哺乳动物HaCaT细胞的SA-β-gal活性水平，增强CK19、β1整合素的表达水平，降低细胞内ROS水平水平，明显提升细胞内ATP水平，改善线粒体形态，从而改善了线粒体网络和提高了细胞抵抗衰老的能力。因此，由人HaCat细胞表达的具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的sirtuin4蛋白可为线粒体功能障碍和机体衰老的预防和治疗提供了一种新的可能性。粘红酵母sirtuin4的这一功能可用于制备防治与细胞线粒体功能低下相关病理过程的药物，食品等领域。附图说明图1为实施例中质粒构建图谱和电泳结果图，其中M：DNAMarker；1:pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2(6283bp)；2：pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4(6106bp)；3：pFlag-CMV-2(4679bp)。图2为实施例中过氧化氢浓度与细胞存活率关系，*p<0.05,**p<0.01vs.Normalgroup.图3为实施例中重组质粒蛋白表达鉴定结果。图4为实施例中HaCaT细胞存活率。图5为实施例中HaCaT细胞半乳糖苷酶活性(bar.50μm)，*p<0.05,**p<0.01vs.Normalgroup,#p<0.05,##p<0.01vs.H2O2group.图6为实施例中HaCaT细胞CK19，CK10，β1整合素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型的sirtuin4蛋白的机制及其应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型的sirtuin4蛋白的机制及其应用。


2.根据权利要求1所述的一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的sirtuin4蛋白，其特征在于，所述sirtuin4蛋白改善细胞衰老表型和线粒体网络的胞内机制是激活受损线粒体自噬相关蛋白，降低哺乳动物细胞的SA-β-gal活性水平，增强CK19、β1整合素的表达水平，降低细胞内ROS水平水平，明显提升细胞内ATP水平，改善线粒体形态。


3.根据权利要求2所述所制备的一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的sirtuin4蛋白在预防和/或治疗线粒体功能障碍相关疾病中的应用。


4.一种预防线粒体功能障碍的功能性食品和/或药品，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求2所述所制备的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，刘梦鸽，利时雨，
申请(专利权)人：广州溯原生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44