检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用制造技术

本发明专利技术公开一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用。本发明专利技术的操作对象为大肠杆菌，无致病风险，操作简单易行。利用SRRz裂解基因作为报告元件，导致微生物菌体裂解，菌液浑浊度明显发生改变，既可通过可见光分光光度计检测，也可通过肉眼直接观察获得结果；且响应迅速，从接触样品到获得结果，仅需30～60min。利用X‑gal对释放到胞外的β‑半乳糖苷酶进行检测，操作简便。应用无需使用到昂贵的仪器，大大减小了检测成本，并使现场检测成为可能。利用含有oNPG的显色凝胶对胞外β‑半乳糖苷酶酶活进行准确定量，检出限低，检测结果准确。本发明专利技术为日常重金属污染检测和突发重金属污染检测提供技术支持。

Whole cell biosensor for the detection of heavy metal ions in water soluble samples and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器及其构建与应用
本专利技术属于环境生物
，特别涉及一种高灵敏检测水溶性样品中重金属离子(二价汞离子或铅离子)的全细胞生物传感器及其构建与应用。
技术介绍
随着工业的发展，重金属污染日益严重，成为突出的环境问题之一。重金属毒性较大，容易在生物体内富集并难以降解，进入食物链后对人体健康带来巨大威胁，因此重金属离子的检测技术显得尤为重要。重金属离子的检测技术主要包括原子吸收光谱法，原子荧光光谱法，电感耦合等离子体法，紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法，电化学分析法，生物检测法，化学显色法。其中原子吸收光谱法，原子荧光光谱法，电感耦合等离子体法，紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法具有高灵敏性和高特异性等优点，但所需仪器价格昂贵、操作复杂、不便携带，主要用于实验室检测，不能作为现场检测的技术。电化学分析法，化学显色法操作简单，容易小型化，可以作为现场检测的技术，但其灵敏度无法往往无法满足要求。由于我国重金属污染严重，操作简便，灵敏度高的重金属的现场实时检测越来越受到重视。特异性的微生物传感器检测是基于工程化菌株对特定小分子物质做出的响应构建而来，其功能主要由两个元件执行。1.由调控蛋白以及其调控的启动子组合而成的感应元件，其通过与特定小分子物质作用后引起基因表达的变化，引起一系列的现象。2.由感应元件控制的，易于检测的蛋白组成的报告元件。1997年Misteli等人从多管水母属AequoreaVictoria中分离得到天然的绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)。由于其自身具有荧光不需要外加底物，并且较为稳定，作为一个报告元件广泛地应用于微生物传感器当中。2002年RobertoFF等人以GFP为报告元件制作了检测As的微生物传感器；2006年LianVH等人基于GFP报告元件检测土壤中的重金属离子；2016年LaraBereza-Malcolm以GFP为报告元件制作了能特异性检测铅的微生物传感器。微生物传感器检测其优点是廉价，操作简单，特异性高，灵敏度较好，但现行的生物检测法还存在一下问题。一是检测周期较长，绿色荧光蛋白虽然有着多种优点，但是其成熟时间较长，往往需要2～3小时才能完全成熟，不利于快速检测。再者GFP的定量需要使用昂贵的仪器，并且仪器不容易携带，不利于进行现场实时的检测。本专利技术所述大肠杆菌可以克服这些不足，构建一种敏感，快速检测水中重金属离子的大肠杆菌，为开发一种廉价，便携的微生物现场检测技术奠定基础。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器。本专利技术的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供上述检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种利用上述全细胞生物传感器快速检测重金属离子的方法。该方法操作便利、灵敏度高、耗时短、成本低、可视性好、易于定量。具有重金属耐受性的微生物在受到相应的重金属的刺激时，会引起一系列重金属耐受性相关的基因的表达。这些基因的表达主要是由以MerR家族蛋白为代表的一类调控蛋白，其可以激活非最优的σ70依赖的启动子，此类启动子的-35区与-10区相差碱基数大于能被σ70因子识别的最优长度17±1bp。当MerR蛋白与汞离子特异性结合后能够使此类启动子的构型发生改变从而使得该启动子能被σ70因子正确识别，从而启动下游基因的转录。本专利技术就是利用MerR蛋白及其类似调控的启动子，从而控制下游报告基因的表达，实现对环境中的重金属离子进行定性、定量的检测。大肠杆菌的λ噬菌体是目前研究最清楚、应用最广泛的噬菌体之一。噬菌体中导致细胞裂解的基因包括S、R和Rz三个基因，其中R基因编码的是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可以引起肽键的水解，分解细胞壁的肽聚糖。Rz基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopepidase)，它可以切割肽聚糖和寡糖之间和/或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的连接。R和Rz基因产物的功能都是降解细胞壁，而S基因产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因的产物穿过细胞质膜，并作用于细胞壁，使细胞壁破碎，释放胞内物质。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)广泛存在于各种微生物中，它能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷键水解，是最成熟的一种报告蛋白。其能催化X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)水解产物显蓝色，易于观察和检测，同时能够催化oNPG(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside，邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)水解，产物呈黄色，β-半乳糖苷酶与oNPG的反应常用于β-半乳糖苷酶的酶活测试中。本专利技术利用重组大肠杆菌作为重金属离子检测菌。该菌株是将特定的重金属离子响应的调控蛋白以及其对应的启动子序列与噬菌体裂解蛋白SRRz基因相连接，与质粒载体连接后导入大肠杆菌，形成能够在重金属离子刺激下发生裂解的大肠杆菌，既为本专利技术中所用的重组大肠杆菌。当重组大肠杆菌遇到相应的重金属离子后，重金属离子进入菌体内与调控蛋白结合，从而启动裂解基因SRRz的表达，导致大肠杆菌裂解，并释放β-半乳糖苷酶。通过本专利技术构建的X-gal凝胶显色方法，既可以利用X-gal进行快速半定量检测，也可以利用酶标仪进行精确的定量检测。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，该全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子；所述的重金属离子响应元件可为重金属离子响应的任意元件，优选为含有双向启动子序列的重金属离子响应元件；更优选为含有双向启动子序列的汞(Hg2+)响应蛋白(SEQIDNo.1)或含有双向启动子序列的铅(Pb2+)响应蛋白(SEQIDNo.2)。所述的噬菌体裂解基因，可为任意一种噬菌体裂解基因，优选为lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中SEQIDNo.3的核苷酸序列。所述的大肠杆菌终止子可为任意一种大肠杆菌终止子，优选为终止子TrrnB，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。所述的重金属离子诱导的基因表达系统所用的出发载体可为任意一种大肠杆菌载体，优选pSB1C3，pBluescript，pUC18，pUC19，pET系列等克隆表达载体。更优选为以pSB1C3为出发载体，构建的大肠杆菌裂解载体为pSB1C3-MHg和pSB1C3-MPb。所述的大肠杆菌优选为E.coliBL21。一种检测水溶性样品中重金属本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：所述全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；/n所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：所述全细胞生物传感器是将重金属离子诱导的基因表达系统转化大肠杆菌中构建得到的；
所述的重金属离子诱导的基因表达系统中自5′到3′端依次连接大肠杆菌终止子、重金属离子响应元件、噬菌体裂解基因、大肠杆菌终止子。


2.根据权利要求1所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：
所述的重金属离子响应元件为含有双向启动子序列的重金属离子响应元件。


3.根据权利要求1或2所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：
所述的重金属离子响应元件为含有双向启动子序列的汞响应蛋白，见SEQIDNo.1或含有双向启动子序列的铅响应蛋白，见SEQIDNo.2；
所述的噬菌体裂解基因为lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；
所述的大肠杆菌终止子为终止子TrrnB，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。


4.根据权利要求1或2所述的检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器，其特征在于：
所述的重金属离子诱导的基因表达系统所用的出发载体为pSB1C3，pBluescript，pUC18，pUC19或pET系列；
所述的大肠杆菌为E.coliBL21。


5.一种检测水溶性样品中重金属离子的全细胞生物传感器的构建方法，其特征在于具体包括如下步骤：以pSB1C3为出发载体：
(1)分别合成汞和铅离子响应的响应蛋白和双向启动子序列，见SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、响应蛋白反向互补编码基因、双向启动子、SpeI、NotI和PstI；
(2)合成裂解基因SRRz，其序列见SEQIDNo.3，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、SRRz裂解基因、SpeI、NotI和PstI；
(3)合成终止子TrrnB，其序列见SEQIDNo.4，序列从5′到3′依次为EcoRI、NotI、XbaI、TrrnB终止子、SpeI、NotI和PstI；
(4)将含有汞离子响应蛋白和双向启动子序列SEQIDNo.1用XbaI和PstI双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQIDNo.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-TrrnB-HgR，其中TrrnB-HgR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
(5)将含有铅离子响应蛋白和双向启动子序列SEQIDNo.2用XbaI和PstI双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQIDNo.4用EcoRI和SpeI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-TrrnB-PbR，其中TrrnB-PbR的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
(6)将含有SRRz裂解基因的序列SEQIDNo.3用EcoRI和SpeI双酶切，含有终止子TrrnB序列SEQIDNo.4用XbaI和PstI双酶切，载体pSB1C3用EcoRI和PstI双酶切，三者在连接酶作用下环化形成pSB1C3-SRRz-TrrnB，其中SRRz-TrrnB的连接是依靠SpeI和XbaI酶切产生同尾序列进行连接的；
(7)质粒pSB1C3-TrrnB-HgR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB1C3-SRRz-TrrnB采用XbaI和PstI双酶切，目的片段纯化后连接获得汞离子响应载体，命名为pSB1C3-MHg；
(8)质粒pSB1C3-TrrnB-PbR采用SpeI和PstI双酶切，质粒pSB...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓敏，李爽，胡日荣，吴柏华，彭晓春，
申请(专利权)人：华南理工大学，广州德隆环境检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44