用于同步检测华法林代谢基因多态性的方法技术

本发明专利技术提供一种同步检测华法林代谢基因多态性的引物组及检测方法，有益于检测通量的提高。本发明专利技术先提供用于同步检测华法林代谢基因多态性的引物组，第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；第三组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术通过一次反应可以对华法林代谢基因多态性进行检测。不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

A method for simultaneous detection of warfarin metabolic gene polymorphism

【技术实现步骤摘要】
用于同步检测华法林代谢基因多态性的方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其是涉及用于同步检测华法林代谢基因多态性的引物组及检测方法。
技术介绍
华法林是目前临床上广泛使用的维生素K拮抗剂类口服抗凝血药，用于静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性脑卒中、心脏瓣膜置换术后、房颤等的抗凝治疗和预防。目前临床使用的华法林制剂是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物，其中S-华法林的抗凝活性是R-华法林的2.7～3.8倍，在体内主要由肝脏细胞色素P4502C9(CYP2C9)进行代谢。CYP2C9基因编码区存在着单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNPs)，其中比较重要的是CYP2C9*2和CYP2C9*3，国外CYP2C9基因研究主要集中在CYP2C9*2和CYP2C9*3，研究表明，具有这两种基因型的个体所需华法林剂量明显降低，出血的风险也随之增加。另外，维生素K环氧化物环氧化酶复合体1(VKORC1)是体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，华法林可竞争性抑制次酶的作用而达到抗凝效果。维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(vitaminKepoxidereductasecomplexsubunit1，VKORC1)基因的变异会导致VKORC1酶的活性降低，进而导致维生素K依赖性凝血因子的功能降低。VKORC1基因1639G＞A位点多态性可解释使用华法林维持剂量的差异。PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。目前，可针对CYP2C9基因的CYP2C9*2(c.430C＞T，rs1799853)、CYP2C9*3(c.1075A＞C，rs1057910)和VKORC1基因的c.1639G＞A(rs9923231)位点分别设计PCR检测试验，以进行基因多态性的检测。由于每个PCR反应只针对一个位点，故检测通量较低。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。
技术实现思路
为了解决上述缺陷，本专利技术的技术目的是提供一种同步检测华法林代谢基因多态性的引物组及检测方法，有益于检测通量的提高。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：首先提供一种用于同步检测华法林代谢基因多态性的引物组，包含下述3对引物对中的至少两对：第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.4所示；第三组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.6所示。本专利技术的引物组尤其是针对华法林代谢基因的特异性扩增所特别设计的，其中第一组引物对是用于检测CYP2C9基因的CYP2C9*2(c.430C＞T，rs1799853)位点的引物对；第二组引物对是用于检测CYP2C9基因的CYP2C9*3(c.1075A＞C，rs1057910)位点的引物对；第三组引物对是用于检测VKORCl基因的c.1639G＞A(rs9923231)位点的引物对。采用多重PCR技术可以同时同步、高效率、高特异性、准确地扩增出所述基因的特异性基因片段，再通过测序，检测其基因多态性。该引物组优选是三组引物对同时使用，以相对最大程度的提高检测通量，也可以按照情况选取其中任意两组、有针对性的针对某个SNP位点及其上下游基因进行扩增反应；当同时使用该三组引物对进行多重PCR扩增反应时，CYP2C9基因的CYP2C9*2(c.430C＞T，rs1799853)、CYP2C9*3(c.1075A＞C，rs1057910)和VKORC1基因的c.1639G＞A(rs9923231)位点同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增3个SNP位点。通常情况下，利用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2来扩增CYP2C9基因的CYP2C9*2(c.430C＞T，rs1799853)位点时，相应扩增产物的片段长度为791bp；利用上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4来扩增CYP2C9基因的CYP2C9*3(c.1075A＞C，rs1057910)位点时，相应扩增产物的片段长度为691bp；利用上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6来扩增VKORC1基因的c.1639G＞A(rs9923231)位点时，相应扩增产物的片段长度为424bp。如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。经过多次试验证明，本专利技术提供的引物对具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备同步检测华法林代谢基因多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出华法林代谢基因多态性的结果。所述试剂盒，主要是包括本专利技术提供的引物组，其中引物的终浓度优选为20-300nM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)的混合物和超纯水。其中DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度均为50-500μM。DNA聚合酶可以选用Taq、KODFX等DNA聚合酶，如此，PCR缓冲液即为与所选用DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。举例来说，选用KODFX这一DNA聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配置上述PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.5～2μl、PCR缓冲液18～30μl、各种dNTP的混合物1～10μl、3个引物对的混合物2-10μl、DNA5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配置的其他体积大小。在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本专利技术的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组DNA的血液、血清、血浆、细胞、组织或口腔拭子样本。在本专利技术提供的引物组的基础上，本专利技术进一步提供一种用于同步检测华法林代谢基因多态性的检测方法，采用所述的引物对进行PCR检测。根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；(2)配置包含所述引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系；(3)对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；(4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同步检测华法林代谢基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物组包含下述3对引物对中的至少两对：第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.4所示；第三组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于同步检测华法林代谢基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物组包含下述3对引物对中的至少两对：第一组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.2所示；第二组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.4所示；第三组引物对的上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.6所示。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一组引物对是用于检测CYP2C9基因的CYP2C9*2(c.430C＞T，rs1799853)位点的引物对；第二组引物对是用于检测CYP2C9基因的CYP2C9*3(c.1075A＞C，rs1057910)位点的引物对；第三组引物对是用于检测VKORC1基因的c.1639G＞A(rs9923231)位点的引物对。


3.权利要求1或2所述的引物组在制备用于同步检测华法林代谢基因多态性的试剂盒中的应用。


4.一种用于同步检测华法林代谢基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物组。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方圆，解娜，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：西安和合医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61