木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法，该菌株的基因组上整合了多拷贝的阿拉伯糖代谢基因表达盒，所述基因表达盒包含基因araA、araB、araD、GAL2和STP2。本发明专利技术的的酿酒酵母菌能够用于代谢木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖而生成乙醇。

Construction of Saccharomyces cerevisiae co using xylose and arabinose

【技术实现步骤摘要】
木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法。
技术介绍
生物乙醇作为一种重要的商业化绿色可再生运输燃料，在美国、巴西以及国内等地已开始部分替代汽油使用。一代燃料乙醇是以淀粉基(如玉米、木薯)或糖基(如甘蔗、甜菜)为原料制得，虽然是目前燃料乙醇的主要获得方式，但是存在“与人争粮、与粮争地、与畜争料、与农争利”的问题，同时在降低温室气体排放方面优势不大。二代燃料乙醇以玉米秸秆、小麦秸秆、稻草等非粮作物为原料，不存在“与人争粮、与粮争地”等问题，温室气体排放也较一代玉米原料乙醇下降67％，因上述优点，成为目前燃料乙醇的发展方向。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可在厌氧条件下快速代谢葡萄糖高得率生产乙醇，同时可耐受低pH环境，适应高密度发酵，对预处理环节产生的各种抑制物成分也有不错的基础耐受能力。此外遗传背景清晰，各种分子工具齐全，便于进行遗传改造，是燃料乙醇生产的优良宿主。虽然酿酒酵母能够利用葡萄糖，但天然无法代谢存在于木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖这样的戊糖成分。所以开发戊糖酵母便成为提高二代燃料乙醇生产经济性的关键。阿拉伯糖是木质纤维素水解液中含量仅次于木糖的戊糖成分，自然界中存在两种典型的阿拉伯糖代谢途径，即细菌中的异构化途径和真菌中的氧化还原途径。异构化途径相比于氧化还原途径，所需步骤少，反应相对简单。阿拉伯糖经转运蛋白转运进入细胞内后，在阿拉伯糖异构酶(araA基因编码)作用下转变为L-核酮糖，L-核酮糖经L-核酮糖激酶(araB基因编码)磷酸化后生成5-磷酸-L-核酮糖，进而在araD基因编码的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶作用下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径最终转变为乙醇。2001年NancyW.Y.Ho实验室(Sedlak,M.andN.W.Ho.EnzymeMicrobTechnol,2001.28(1):p.16-24.)首次在酿酒酵母中引入大肠杆菌(Escherichiacoli)来源的阿拉伯糖异构化途径基因araA、araB和araD，但是未能将阿拉伯糖转化为乙醇。基于同样的异构化路线，随后EckhardBoles实验室(Becker,J.andE.Boles.ApplEnvironMicrobiol,2003.69(7):p.4144-4150.)使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的araA替换大肠杆菌来源，同时过表达酵母内源的糖转运蛋白基因GAL2，可是重组菌株依然无法利用阿拉伯糖生长。该实验室随后在此基础上又尝试了不同细菌来源的araA基因，发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)来源的效果较好，同时对其和大肠杆菌来源的araB、araD基因进行密码子优化，获得的菌株150h消耗30g/l阿拉伯糖(Wiedemann,B.andE.Boles.ApplEnvironMicrobiol,2008.74(7):p.2043-50.)，暗示途径基因的有效表达可能是瓶颈。最近研究人员基于植物乳杆菌来源的araABD基因序列在数据库搜索同源序列以寻找新的基因来源，发现戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)来源的araABD与之有较高相似度，将之导入酿酒酵母后依然无法利用阿拉伯糖(Caballero,A.andJ.L.Ramos.Microbiology,2017.163(4):p.442.)。显然直接在酿酒酵母导入异构化途径无法实现菌株高效代谢阿拉伯糖。JackT.Pronk将基因工程改造后的IMS0001菌株在阿拉伯糖为唯一碳源恒化器中培养，最后得到60h可完全消耗20g/l阿拉伯糖的菌株IMS0002(Wisselink,H.W.,etal.,ApplEnvironMicrobiol,2007.73(15):p.4881-91.)，但是该菌株丧失了原有的木糖代谢能力，在木糖培养基长期培养后得到能够在木糖平板长出的菌株，为进一步提升该菌混糖代谢能力，研究人员开发了在阿拉伯糖，木糖加阿拉伯糖，葡萄糖加木糖加阿拉伯糖3种培养基交替驯化的新型策略，最后得到目前报道的混糖利用表型最好的菌株IMS0010，该菌能够在30h内消耗30g/l葡萄糖，15g/l木糖和15g/l阿拉伯糖，产醇25.8g/l，糖醇转化率高达0.43gg-1(Wisselink,H.W.,etal.,ApplEnvironMicrobiol,2009.75(4):p.907-14.)。将戊糖片球菌来源的araABD基因整合到酿酒酵母同时经过约1600h驯化同样使得菌株阿拉伯糖代谢能力大幅提升(Caballero,A.andJ.L.Ramos.Microbiology,2017.163(4):p.442.)。鲍晓明实验室(Wang,C.,etal.,BiomedResInt,2017.2017:p.5318232.)将植物乳杆菌来源的araABD进行密码子优化在酿酒酵母表达，同时过表达磷酸戊糖途径基因，结合驯化手段得到快速代谢阿拉伯糖菌株BSW3AP，该菌最大阿拉伯糖消耗速率为0.49gg-1h-1，乙醇转化率为0.42gg-1。在BSW3AP基础上过表达阿拉伯糖转运蛋白Gal2p，最大阿拉伯糖消耗速率进一步提升到0.61gg-1h-1。研究表明，阿拉伯糖异构化途径基因的高表达、磷酸戊糖途径相关基因的高表达以及阿拉伯糖转运蛋白的高表达对于酿酒酵母快速代谢阿拉伯糖有着重要作用。虽然已有一些解析驯化后菌株阿拉伯糖表型利用提升的机制报道，但是尚未有直接在驯化前菌株进行基因操作实现不依赖驯化理性重构阿拉伯糖酵母菌株的报道。对于许多利用木糖和/或阿拉伯糖等戊糖成分进行乙醇生产的酿酒酵母工程菌而言，驯化是必经的处理筛选过程。基因工程改造后的菌株的驯化往往涉及到遗传性状和基因组的改变，因此是一个反复筛选和变异的过程，周期较长。因此如何克服酿酒酵母工程菌须经长期驯化才能同时高效转化木糖和阿拉伯糖的限制瓶颈已成为一个急需解决的问题。
技术实现思路
基于现有技术获得的木糖和阿拉伯糖基因工程菌必须依赖耗时费力的驯化手段，同时菌株对于木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖代谢能力不够强、乙醇生产能力低、因而难以实现工业化应用，本专利技术利用基因工程技术来改造可利用木糖产生乙醇的酿酒酵母菌(本文中简称为木糖酵母)，通过增强或改变与木糖和阿拉伯糖转化相关的代谢途径，构建得到一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种阿拉伯糖代谢基因表达盒(L-ArabinoseUtilizationCassette，AUC)，其包含下述5个基因：地衣芽孢杆菌来源的阿拉伯糖异构酶表达基因araA(优选经密码子优化的araA)，大肠杆菌来源的L-核酮糖激酶表达基因araB，大肠杆菌来源的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶表达基因araD(优选经密码子优化的araD)，酿酒酵母来源的阿拉伯糖转运体基因GAL2和拟南芥来源的阿拉伯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿拉伯糖代谢基因表达盒，其包含下述5个基因：地衣芽孢杆菌来源的阿拉伯糖异构酶表达基因araA，大肠杆菌来源的L-核酮糖激酶表达基因araB，大肠杆菌来源的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶表达基因araD，酿酒酵母来源的阿拉伯糖转运体基因GAL2和拟南芥来源的阿拉伯糖转运体基因STP2。/n

【技术特征摘要】
1.一种阿拉伯糖代谢基因表达盒，其包含下述5个基因：地衣芽孢杆菌来源的阿拉伯糖异构酶表达基因araA，大肠杆菌来源的L-核酮糖激酶表达基因araB，大肠杆菌来源的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶表达基因araD，酿酒酵母来源的阿拉伯糖转运体基因GAL2和拟南芥来源的阿拉伯糖转运体基因STP2。


2.如权利要求1所述的阿拉伯糖代谢基因表达盒，其特征在于，从上游至下游依次包括基因araB表达元件、基因araA表达元件、基因araD表达元件、基因GAL2表达元件和基因STP2表达元件，其中
所述基因araA表达元件的碱基序列为SEQIDNO:1，基因araB表达元件的碱基序列为SEQIDNO:2，基因araD表达元件的碱基序列为SEQIDNO:3，基因GAL2表达元件的碱基序列为SEQIDNO:4，基因STP2表达元件的碱基序列为SEQIDNO:5。


3.如权利要求1或2所述的阿拉伯糖代谢基因表达盒，其特征在于，不包含基因STP2表达元件。


4.一种质粒，其包含如权利要求1-3中任一项所述的阿拉伯糖代谢基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，王心，杨俊杰，蒋宇，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31