【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】实时制备用于质谱分析的多肽样品的系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年8月1日提交的题为“用于对样品执行实时测定的系统和方法(SystemsandMethodsforPerformingaReal-TimeAssayofaSample)”的美国临时专利申请号62/539,803的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
本披露总体上涉及测定，并且更具体地，涉及对样品执行实时测定。序列表本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为名为“51800_Seqlisting.txt”的文件提供，所述文件创建于2018年7月31日，大小为263,964字节。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
技术介绍
测定通常用于量化分析物(如药物、生化物质、或细胞)的一个或多个属性。这种测定的一个实例是多属性方法(MAM)测定，其可以检测和量化样品的关键质量属性(CQA)，所述关键质量属性由质量目标产物概况(QTPP)鉴别(Developmentofaquantitativemassspectrometrymulti-attributemethodforcharacterization,qualitycontroltestinganddispositionofbiologics[用于生物制剂的表征、质量控制测试和处置的定量质谱多属性方法的开发].RogersRS,NightlingerNS,LivingstonB,CampbellP,BaileyR,BallandA.MAbs.2...
【技术保护点】
1.一种进行实时测定的方法，所述方法包括以下步骤：/n(a)将含有多肽的产物的样品经由第一保持盘管移动至多肽结合柱；/n(b)将所述样品中的所述多肽结合至所述多肽结合柱，从而将所述样品中的所述多肽与所述样品的其余部分分离；/n(c)将洗脱缓冲溶液经由所述第一保持盘管并通过所述多肽结合柱下游的第二保持盘管从缓冲液源移动至所述多肽结合柱，从而洗脱与所述多肽结合柱结合的多肽，并将包含所述洗脱缓冲溶液和洗脱的多肽的洗脱液/多肽混合物移动至所述第二保持盘管；/n(d)将所述洗脱液/多肽混合物从所述第二保持盘管移动至反应室；/n(e)将所述洗脱液/多肽混合物中的所述多肽在所述反应室中进行孵育，从而产生变性的多肽；/n(f)在(e)之后，将切割二硫键交联的还原试剂经由第一保持盘管移动至所述反应室；/n(g)将所述变性的多肽与所述还原试剂在所述反应室中进行孵育，从而产生变性和还原的多肽；/n(h)在(g)之后，将使巯基烷基化的烷基化试剂移动至所述反应室；/n(i)将所述变性和还原的多肽与所述烷基化试剂在所述反应室中进行孵育，从而使所述变性和还原的多肽烷基化；/n(j)将所述变性、还原并烷基化的多肽，所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170801 US 62/539,8031.一种进行实时测定的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将含有多肽的产物的样品经由第一保持盘管移动至多肽结合柱；
(b)将所述样品中的所述多肽结合至所述多肽结合柱，从而将所述样品中的所述多肽与所述样品的其余部分分离；
(c)将洗脱缓冲溶液经由所述第一保持盘管并通过所述多肽结合柱下游的第二保持盘管从缓冲液源移动至所述多肽结合柱，从而洗脱与所述多肽结合柱结合的多肽，并将包含所述洗脱缓冲溶液和洗脱的多肽的洗脱液/多肽混合物移动至所述第二保持盘管；
(d)将所述洗脱液/多肽混合物从所述第二保持盘管移动至反应室；
(e)将所述洗脱液/多肽混合物中的所述多肽在所述反应室中进行孵育，从而产生变性的多肽；
(f)在(e)之后，将切割二硫键交联的还原试剂经由第一保持盘管移动至所述反应室；
(g)将所述变性的多肽与所述还原试剂在所述反应室中进行孵育，从而产生变性和还原的多肽；
(h)在(g)之后，将使巯基烷基化的烷基化试剂移动至所述反应室；
(i)将所述变性和还原的多肽与所述烷基化试剂在所述反应室中进行孵育，从而使所述变性和还原的多肽烷基化；
(j)将所述变性、还原并烷基化的多肽，所述洗脱缓冲溶液，所述还原试剂和所述烷基化试剂经由所述第一保持盘管从所述反应室移动至脱盐柱，所述脱盐柱用蛋白质水解缓冲液平衡；
(k)将所述变性、还原并烷基化的多肽应用至所述脱盐柱，从而将所述变性、还原并烷基化的多肽与所述还原试剂和烷基化试剂分离，从而得到脱盐的多肽；
(l)将所述脱盐的多肽移动至所述脱盐柱下游的蛋白水解酶柱；
(m)在第三多肽柱中消化所述脱盐的多肽，从而产生消化的多肽；以及
(n)将所述消化的多肽移动至分析装置以分析所述消化的多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中自动执行(a)、(c)、(d)、(f)、(h)、(i)、(l)和(n)中的一个或多个。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中(a)至(n)在封闭系统中执行。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中(a)包括将多通路阀定位在第一位置，在所述第一位置中，所述第一保持盘管和所述多肽结合柱经由所述多通路阀的第一通路流体地联接。
5.如权利要求4所述的方法，其中(d)包括将所述多通路阀定位在第二位置，在所述第二位置中，所述第二保持盘管和所述反应室经由所述多通路阀的第二通路流体地联接。
6.如权利要求5所述的方法，其中(f)和(h)各自包括将所述多通路阀定位在第三位置，在所述第三位置中，所述第一保持盘管和所述反应室经由所述多通路阀的第三通路流体地联接。
7.如权利要求6所述的方法，其中(j)包括：
将所述变性、还原并烷基化的多肽，所述洗脱缓冲溶液，所述还原试剂和所述烷基化试剂经由所述多通路阀的所述第三通路从所述反应室移动至所述脱盐柱；并且
将所述多通路阀定位在第四位置，在所述第四位置中，所述第一保持盘管和所述脱盐柱经由所述多通路阀的第四通路流体地联接。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在(d)之前或期间，将与所述反应室流体地联接并位于其下游的第一阀移动至第一位置，在所述第一位置中，所述第一阀将从所述第一保持盘管接收的超过所述反应室容积的内容物引导至废物室。
9.如权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括在(i)之后，将所述第一阀从所述第一位置移动至第二位置，在所述第二位置中，所述第一阀将空气引导至所述反应室中。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在(k)之后并且在(l)之前，(o)将与所述脱盐柱和所述蛋白水解酶柱流体地联接并位于其之间的第二阀从第一位置移动至第二位置，在所述第一位置中所述第二阀将从所述脱盐柱接收的内容物引导至废物室，在所述第二位置中所述第二阀将从所述脱盐柱接收的内容物引导至所述蛋白水解酶柱。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中(a)包括将所述产物的所述样品经由所述第一保持盘管从含有所述多肽的容器移动至所述多肽结合柱。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在(d)之前，用变性试剂至少部分地填充所述反应室，并且其中(e)包括将所述洗脱液/多肽混合物中的多肽与所述变性试剂在所述反应室中进行孵育。
13.如权利要求12所述的方法，其中用所述变性试剂至少部分地填充所述反应室包括将所述变性试剂经由所述第一保持盘管从变性缓冲液源移动至所述反应室。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述反应室施加热。
15.如权利要求12所述的方法，其中(j)进一步包括将所述变性试剂经由所述第一保持盘管从所述反应室移动至所述脱盐柱，并且其中(k)进一步将所述变性、还原并烷基化的多肽与所述变性试剂分离。
16.一种用于使用封闭系统执行实时测定的方法，所述封闭系统包括多通路阀、在所述多通路阀上游的第一保持盘管、与所述多通路阀的第一通路流体地联接并位于其下游的多肽结合柱、与所述多肽结合柱流体地联接并位于其下游的第二保持盘管、与所述多通路阀的第二和第三通路流体地联接并位于其下游的反应室、与所述多通路阀的第四通路流体地联接并位于其下游的脱盐柱，以及在所述脱盐柱下游的蛋白水解酶柱，所述方法包括：
(a)经由与所述封闭系统通信地联接的控制器，将含有多肽的产物的样品移动至所述第一保持盘管；
(b)经由所述控制器将所述多通路阀定位在第一位置，在所述第一位置中，所述第一保持盘管经由所述多通路阀的所述第一通路连接至所述多肽结合柱，使得所述样品流动至第一柱，从而所述样品中的多肽结合至所述多肽结合柱上；
(c)当所述多通路阀处于所述第一位置时，经由控制器将洗脱缓冲溶液从洗脱缓冲溶液源经由所述多肽结合柱移动至所述第二保持盘管，使得所述洗脱缓冲溶液洗脱基本上所有与所述多肽结合柱结合的多肽；
(d)经由所述控制器将所述多通路阀移动至第二位置，在所述第二位置中，所述第二保持盘管经由所述多通路阀的所述第二通路连接至所述反应室；
(e)当所述多通路阀处于所述第二位置时，经由所述控制器将包含所述洗脱缓冲溶液和洗脱的多肽的洗脱液/多肽混合物移动至所述反应室，从而使所述洗脱液/多肽混合物中的多肽变性；
(f)经由所述控制器将多通路阀移动至第三位置，在所述第三位置中，所述第一保持盘管经由所述多通路阀的所述第三通路连接至所述反应室；
(g)在(f)之后，经由所述控制器将切割二硫键交联的还原试剂移动至所述第一保持盘管，并且经由所述控制器将所述还原试剂从所述第一保持盘管经由所述多通路阀的所述第三通路移动至所述反应室，从而还原所述变性的多肽；
(h)在(g)之后，经由所述控制器将使巯基烷基化的烷基化试剂移动至所述第一保持盘管，并且经由所述控制器将所述烷基化试剂从所述第一保持盘管经由所述第三通路移动至所述反应室，从而烷基化所述变性和还原的多肽；
(i)经由所述控制器将所述烷基化的多肽、所述洗脱缓冲溶液、所述还原试剂和所述烷基化试剂从所述反应室经由所述第三通路移动至所述第一保持盘管；
(j)经由所述控制器将所述多通路阀移动至第四位置，在所述第四位置中，所述第一保持盘管经由所述多通路阀的第四通路连接至所述脱盐柱，并且当所述多通路阀处于在所述第四位置时，将所述烷基化的多肽、所述洗脱缓冲溶液、所述还原试剂和所述烷基化试剂从所述第一保持盘管移动至所述脱盐柱，从而将所述变性、还原并烷基化的多肽应用至所述脱盐柱，由此将所述变性、还原并烷基化的多肽与所述还原试剂和烷基化试剂分离，得到脱盐的多肽；
(k)经由所述控制器将所述脱盐的多肽移动至所述蛋白水解酶柱，从而消化所述脱盐的多肽；以及
(l)经由所述控制器将所述消化的多肽传送至分析装置，从而分析所述消化的多肽。
17.如权利要求16所述的方法，其中(a)包括经由所述控制器将所述样品从含有所述多肽的容器移动至所述第一保持盘管。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中(k)包括将所述消化的多肽传送至选自由以下组成的组的分析装置：液相色谱装置、高效液相色谱装置、超高效液相色谱装置、质谱装置和聚糖分析装置，或其组合。
19.如权利要求16至18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在(e)之前，经由所述控制器将所述多通路阀移动至所述第三位置，并经由所述控制器将变性试剂移动至所述反应室。
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述变性试剂移动至所述反应室包括：经由所述控制器将所述变性试剂从变性缓冲液源经由泵移动至所述第一保持盘管，并经由所述控制器将所述变性试剂从所述第一保持盘管经由所述多通路阀的第三通路移动至所述反应室。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中(i)进一步包括将所述变性试剂从所述反应室经由所述第三通路移动至所述第一保持盘管，并且其中(j)进一步包括将所述变性试剂从所述第一保持盘管移动至所述脱盐柱，并且当所述变性、还原并烷基化的多肽应用于所述脱盐柱时，所述变性、还原并烷基化的多肽与所述变性试剂借此进一步分离。
22.一种用于执行联机实时测定的封闭系统，所述系统包括：
第一保持盘管，所述第一保持盘管流体地布置成接收含有多肽的产物的样品；
多通路阀，所述多通路阀流体地联接至所述第一保持盘管并位于其下游；
多肽结合柱，所述多肽结合柱流体地联接至所述多通路阀，并布置成经由所述多通路阀的第一通路从所述第一保持盘管接收所述样品，所述多肽结合柱被配置为结合来自所述样品的所述多肽，
缓冲液源，所述缓冲液源流体地联接至所述多通路阀，并被布置成向位于所述多肽结合柱下游的第二保持盘管供应洗脱缓冲溶液，使得所述洗脱缓冲溶液适于从所述多肽结合柱上洗脱基本上所有的所述多肽；
反应室，所述反应室流体地联接至所述多通路阀并被布置在所述多肽结合柱下游，所述反应室适于经由所述多通路阀的第二通路从所述多肽结合柱接收混合物，所述混合物包含所述洗脱缓冲溶液和所述洗脱的多肽，其中所述混合物的多肽在所述反应室中变性，其中所述反应室被布置成经由所述多通路阀的第一保持盘管和第三通路接收切割二硫键交联的还原试剂，所述还原试剂还原所述变性的多肽，并且其中所述反应室还被布置成经由所述多通路阀的第一保持盘管和第三通路接收使巯基烷基化的烷基化试剂，其中所述烷基化试剂在所述反应室中将所述变性并还原的多肽烷基化；
脱盐柱，所述脱盐柱流体地联接至所述多通路阀，并且被布置成从所述反应室接收变性、还原并烷基化的多肽，所述洗脱缓冲溶液和所述烷基化试剂，所述脱盐柱被配置为将所述变性、还原并烷基化的多肽与所述洗脱缓冲溶液、所述还原试剂和所述烷基化试剂分离；以及
蛋白水解酶柱，所述蛋白水解酶柱流体地联接至第二多肽柱并被布置成在其下游以从所述脱盐柱获得所述分离的多肽，所述蛋白水解酶柱被配置为消化脱盐的多肽。
23.如权利要求22所述的系统，所述系统进一步包括生物反应器，所述生物反应器被配置为产生含有多肽的产物，其中所述第一保持盘管流体地联接至所述生物反应器。
24.如权利要求22或23所述的系统，其中所述多通路阀包含12个卫星通路和中心共享通路阀。
25.如权利要求22至24中任一项所述的系统，其中所述多肽结合柱选自由以下组成的组：蛋白A柱、蛋白G柱、蛋白A/G柱、蛋白L柱、氨基酸柱、亲和素柱、链霉亲和素柱、碳水化合物结合柱、碳水化合物柱、谷胱甘肽柱、肝素柱、疏水相互作用柱、免疫亲和柱、核苷酸/辅酶柱、专门柱和固定化金属亲和色谱(IMAC)柱。
26.如权利要求22至25中任一项所述的系统，所述系统进一步包括泵，所述其被配置为将所述产物的样品从所述生物反应器泵送至所述第一保持盘管。
27.如权利要求22至26中任一项所述的系统，其中所述还原试剂选自由以下组成的组：二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽、β-巯基乙醇(β-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
28.如权利要求22至27中任一项所述的系统，其中所述烷基化试剂是吲哚-3-乙酸(IAA)。
29.如权利要求22至28中任一项所述的系统，其中所述脱盐柱是尺寸排阻色谱柱。
30.如权利要求22至29中任一项所述的系统，其中所述蛋白水解酶柱包含蛋白水解酶，并且其中所述蛋白水解酶是内肽酶。
31.如权利要求30所述的系统，其中所述内肽酶选自由以下组成的组：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、谷氨酰内肽酶、脑啡肽酶、Lys-C蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶。
32.如权利要求22至31中任一项所述的系统，其中所述反应室至少部分地预填充有变性试剂。
33.如权利要求32所述的系统，所述系统进一步包括泵，所述泵被配置为将所述变性试剂从变性缓冲液源经由所述第一保持盘管泵送至所述反应室。
34.如权利要求32或33所述的系统，其中所述变性试剂包括变性去污剂或离液剂。
35.如权利要求34所述的系统，其中所述离液剂选自由以下组成的组：尿素、正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、和硫脲。
36.如权利要求34所述的系统，其中所述变性去污剂选自由以下组成的组：十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸锂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三甲基(十四烷基)溴化铵(TTAB)。
37.如权利要求36所述的系统，其中所述变性去污剂是SDS。
38.如权利要求32所述的系统，其中所述变性试剂包括加热的流体。
39.如权利要求22至38中任一项所述的系统，所述系统进一步包括加热元件，所述加热元件紧邻所述反应室定位，所述加热元件被配置为向所述反应室施加热。
40.如权利要求39所述的系统，其中所述热具有在约22℃至约120℃之间的温度。
41.如权利要求40所述的系统，其中所述热具有约40℃的温度。
42.如权利要求22至41中任一项所述的系统，所述系统进一步包括第一阀，所述第一阀流体地联接至所述反应室并位于其下游，其中所述第一阀在第一位置和第二位置中可操作，在所述第一位置中所述第一阀将从所述第一保持盘管接收的超过所述反应室容积的内容物引导至废物，在所述第二位置中所述第一阀将空气引导至所述反应室中。
43.如权利要求42所述的系统，所述系统进一步包括控制器，所述控制器通信地联接至所述第一阀以控制所述第一阀的位置，其中在将所述变性、还原并烷基化的多肽，所述洗脱缓冲溶液，所述变性试剂，所述还原试剂和所述烷基化试剂从所述反应室移动至所述脱盐柱之前，所述控制器将所述第一阀从所述第一位置移动至所述第二位置。
44.如权利要求22至43中任一项所述的系统，所述系统进一步包括第二阀，所述第二阀流体地联接至所述脱盐柱和所述蛋白水解酶柱并位于其之间，其中所述第二阀在第一位置和第二位置中可操作...
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