利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法技术

本发明专利技术涉及包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体以及向细胞内传递靶物质的方法。在本发明专利技术的方法中，不仅在细胞外将包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，还在细胞外将人为制备的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，可使用强力的能量强度的体外冲击波，可有效地向体外囊泡内传递靶物质，并且，若以体外冲击波进行处理，则导入靶物质的上述细胞外囊泡向目的细胞的掺入能力也增加，通过本发明专利技术的方法能够以高效率向细胞内传递靶物质，从而可利用于各种领域。

The method of target material transfer to extracellular vesicles by extracorporeal shock wave

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法
本专利技术涉及包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体及向细胞内传递靶物质的方法。
技术介绍
冲击波为通过特定声波发生器生成的连续的单一声波，具有100MPa为止的高峰值压力的振幅，具有小于1μs的短的持续时间，能够以0.005mJ/mm2至1.0mJ/mm2范围的能量密度向特定靶部位传递。高能量的体外冲击波碎石术(extracorporealshock-wavelithotripsy，ESWL)为向人体特定部位照射35MPa至100MPa的压力的治疗方法，自从用于分解肾和胆管的结石以来，作为新的治疗方法在各种领域尝试。最近，体外冲击波碎石术用于肌肉骨骼疾病治疗，对抗炎症作用及血流增加有效。细胞外囊泡为由双层脂质膜形成的具有数十nm至数百nm的大小的纳米囊泡，由蛋白质、脂质、基因等生物活性的物质构成。在以往，将这种细胞外囊泡视作在细胞中分泌的残渣，最近，随着出现细胞外囊泡的临床意义，进行各种研究。尤其，作为被细胞排出的球形小泡的外泌体具有母细胞的蛋白质、DNA等的各种信息，因此，积极研究将外泌体用作生物标记物的癌症诊断标记物及传感器。如一例，具有提出如下的可能性的研究，即，在存在于患者的血液内的细胞外囊泡中，基于变形的形态的EGFRⅧ的基因探测与否，诊断胶质母细胞瘤。并且，还具有在存在于患者的小便内的细胞外囊泡中，通过分析来源于癌细胞的细胞外囊泡的基因组来确认作为前列腺癌生物标记物的PCA-3及TMPRSS2：ERG的存在的研究结果。同时，在韩国专利授权第10-1704828号揭示通过分析在体液内的细胞外囊泡内存在的炎症疾病关联基因表达量来诊断炎症疾病的方法。另一方面，在韩国专利授权第10-1719569号中，在本专利技术之前，本专利技术人通过确认在进行体外冲击波处理的细胞中导入所要的靶物质的外泌体、核外颗粒体、微泡或凋亡小体等的细胞外囊泡的生成及分泌增加，来确认了生成含靶物质的细胞的方法。但是，上述方法仅确认转化过程以通过向细胞施加的体外冲击波生成的细胞外囊泡为媒介进行，细胞外囊泡，尤其，未揭示利用外泌体本身的机制及直接利用其的转化方法。相比于利用细胞的治疗方法，基于外泌体的药物传递或治疗没有血管闭合效应，可降低诱发二次继发性微血管血栓形成的风向及肿瘤形成的风险。并且，可通过少量的细胞获取大量外泌体，如上所述，所获取的大量的外泌体具有稳定性、容易储存、不诱发免疫排斥反应、容易适用于临床的诸多优点。因此，相比于以细胞为媒介的治疗法，需要研究得到改善的利用外泌体本身的细胞治疗法。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术人在研究转化过程中向作为传递靶物质的介质的细胞外囊泡内传递靶物质的方法时，经确认，与以往的授权专利第10-1719569号不同地，若在细胞外囊泡处理能量等级高的体外冲击波，靶物质向细胞外囊泡的导入率增加，对于导入上述靶物质的细胞外囊泡的细胞的掺入能力增加。并且，作为负载靶物质的细胞外囊泡，捕集内壳利用包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡，还可利用人为制备的细胞外囊泡，经确认，若利用体外冲击波，向所目的的细胞传递靶物质的效率增加，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的在于，提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体及向细胞内传递靶物质的方法。解决问题的方案为实现上述目的，本专利技术提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法。并且，本专利技术提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法。并且，本专利技术提供通过上述方法制备的细胞外囊泡。并且，本专利技术提供包含上述细胞外囊泡的药物载体。并且，本专利技术提供向细胞内传递靶物质的方法，包括：步骤(a)，将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波，来向细胞外囊泡内导入靶物质；以及步骤(b)，利用导入靶物质的上述细胞外囊泡处理细胞。前述
技术实现思路
仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了以上描述的说明性方面、实施例和特征之外，其它方面、实施例和特征将通过参考附图和以下详细描述变得明显的。专利技术的效果在本专利技术的方法中，不仅在细胞外将包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，还在细胞外将人为制备的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，可使用强力的能量强度的体外冲击波，可有效地向体外囊泡内传递靶物质。并且，若进行体外冲击波处理，则导入靶物质的上述细胞外囊泡向目的细胞的掺入能力也增加，通过本专利技术的方法能够以高效率向细胞内传递靶物质，从而可利用于各种领域。附图说明图1为示出根据体外冲击波处理与否测定外泌体分散溶液的ζ-电位的变化的结果的图。图2为示出利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)设备测定根据体外冲击波与否的外泌体大小变化的结果的图。图3为示出在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对进行体外冲击波处理的来源于血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体进行处理，并根据能量等级比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体掺入(incorporation)程度的实验结果的图。图4为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入siRNA(siGlo)及比较分析导入siRNA的上述外泌体的掺入能力的结果的图。图5为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入红色荧光蛋白及比较分析导入蛋白质的上述外泌体的掺入能力的结果的图。图6为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入microRNA及比较分析导入microRNA的上述外泌体的掺入能力的结果的图。图7为示出在各种细胞中与对照组ESWX比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于人脐静脉内皮细胞的细胞外囊泡ESWO的microRNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。图8为示出在各种细胞中与对照组ESWX比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于间充质干细胞(MSC)的细胞外囊泡ESWO的microRNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。图9为示出在各种细胞中与对照组ESWX比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外囊泡ESWO的microRNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。图10为示出在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的来源于牛乳外泌体进行处理，并与对照组比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体掺入程度的结果的图。图11为示出人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的来源于西柚的外泌体进行处理，并与对照组比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种向细胞外囊泡内传递靶物质的方法，其特征在于，包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170602 KR 10-2017-0069309;20180516 KR 10-2018-001.一种向细胞外囊泡内传递靶物质的方法，其特征在于，包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤。


2.根据权利要求1所述的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法，其特征在于，上述靶物质为选自由核酸、蛋白质及化合物组成的组中的一种以上。


3.根据权利要求1所述的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法，其特征在于，上述体外冲击波的能量范围为0.05mJ/mm2至0.9mJ/mm2。


4.根据权利要求1所述的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法，其特征在于，上述细胞外囊泡为选自由外泌体、核外颗粒体、微泡及凋亡小体组成的组中的一种以上。

【专利技术属性】
技术研发人员：权起焕，郑智化，金暻花，
申请(专利权)人：艾科索伦斯生物科技，
类型：发明
国别省市：韩国;KR