生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途制造技术

本发明专利技术涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活化变体作为选择标记物在细胞培养中的用途。

The use of constitutive active variants of growth factor receptor as selective markers in the formation of stable production cell lines

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生长因子受体的组成型活性变体作为选择标记物在生成稳定生产细胞系中的用途本专利技术涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，所述方法包括用编码生长因子受体的组成型活性变体的基因稳定转染细胞；还涉及在这种稳定生产细胞系中表达一种或多种POI的相应的方法；以及生长因子受体的组成型活性变体作为选择标物记在细胞培养中的用途。选择标记物是用于生成稳定生产细胞系(即稳定表达一种或多种POI例如生物药的细胞系)的必要工具。通常，这些选择标记物是抗生素抗性基因，其在表达载体上编码，并且与目的基因(GOI)一起稳定地整合在靶基因组中(例如通过转染)。在相应的抗生素存在的情况下培养转染的细胞用于选择具有整合表达载体的生产细胞。用于哺乳动物表达系统的常用的基于抗生素的选择标记物包括，例如来自蜡样芽孢杆菌(Bacilluscerus)或土曲霉(Aspergillusterreus)的灭瘟素S抗性基因、来自转座子Tn5(neo)的G418(遗传霉素)抗性基因、来自链霉菌(Streptomycesspp.)的嘌呤霉素抗性基因、来自大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)的潮霉素B抗性基因和来自印度斯坦异壁链霉菌(Streptoalloteichushindustanus)的博来霉素(Zeocin)抗性基因。基于抗生素抗性的选择标记物的缺点包括以下事实：只有非常有限的一组选择标记物可用。此外，存在不稳定的生产克隆的问题，特别是在表达非常大的多聚体蛋白时，其中靶蛋白的重组表达随着时间的推移而沉默，从而导致生产过程中的低滴度。为了防止沉默，这些细胞可以在相应的抗生素选择剂的存在下培养。然而，在抗生素存在的情况下大规模生产POI是不希望的，因为这需要在生产后进行大量的去除步骤和分析步骤。因此，迫切需要新的选择标记物，例如如果需要稳定整合多个表达构建体，则允许增强细胞系的稳定性并易于使用。理想地，这样的新选择标记物在没有选择剂的情况下支持POI的持续表达。因此，本专利技术的技术问题是提供相应的选择标记物和使用选择标记物的方法。通过在权利要求书中表征的实施方案来实现解决上述技术问题的方案。特别地，第一方面，本专利技术涉及选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：(a)提供细胞系，(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子，以及(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及(c)在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。通常，通过结合相应的配体即相应的生长因子(例如，IGF-1、IFG-2或IGF-1R的胰岛素)而激活生长因子受体，随后的二聚化导致下游磷酸化事件以及包括MAP-激酶和NFkappaB途径在内的促生长和抗凋亡途径的激活。这些生长因子存在于血清中，并且在无血清生长培养基中培养依赖于这些因子的细胞时需要补充。表现出对IGF-1和胰岛素的生长反应的细胞包括CAP、CHO、BHK、HEK293、Vero、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。培养这种细胞通常需要补充生长因子，这增加了相应生产过程的成本。本专利技术实现了一种新方法，即，在细胞培养基中稳定地整合组成型活性生长因子受体变体和通过生长因子耗竭进行的正向选择，从而允许在无蛋白质的培养基中生产。如本文所用，术语“选择”系指通过建立选择压力来允许期望的阳性细胞克隆的排他性存活和增殖的过程，即，根据本专利技术，在细胞培养基中培养所述细胞，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子，而不需要的阴性细胞克隆是在所述选择压力下无法生存和增殖。术语“选择”的使用应与所需细胞的物理分离和/或富集明显区别，例如通过分选或附着，从更大的细胞池中分离出来。如本文所用，术语“生产细胞系”系指细胞系生产即表达一种或多种POI。在这方面，术语“稳定生产细胞系”系指这样的事实：编码所述POI的基因(目的基因；GOI)，以及编码生长因子受体的组成型活性变体的基因被稳定地整合至细胞基因组中。在具体实施方案中，本专利技术的方法的步骤(a)中提供的细胞系是哺乳动物细胞系，包括人细胞系。优选地，细胞系选自CHO细胞、HEK293细胞、CAP细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、Vero细胞、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。更优选地，该细胞是CAP细胞系。本专利技术中使用的由细胞系表达的POI没有特别的限制。它们包括可能需要表达的任何蛋白质，例如选自细胞外基质蛋白质、生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子、蛋白酶抑制剂和病毒蛋白产物。具体实例包括人重组α-1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，纤维蛋白原，层粘连蛋白(LAM)，干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，双特异性单克隆抗体(BsAb)，促红细胞生成素(EPO)，凝血因子VII(FVII)，凝血因子VIII(FVIII)，凝血因子IX(FIX)，von-Willebrand因子(vWF)，C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1Inh)，来自HIV-1、HIV-2、EIAV、SIV或其他逆转录病毒科(gag-pol)的gag-pol，来自腺相关病毒的rep蛋白(REP)，来自腺相关病毒的cap蛋白(CAP)及其变体。在本专利技术的方法的步骤(b)中，用(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子；以及(ii)编码所述POI的一种或多种GOI来稳定转染细胞系。相应的转染方法没有特别限制并且是本领域已知的。如本文所用，术语“稳定转染”表示以下事实：相应基因被稳定地整合至细胞基因组中。术语“其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子”表明以下事实：为了使本专利技术的方法按要求工作，必须选择生长因子受体/生长因子，使得在天然条件下，即在未转染的细胞中，细胞的生长取决于所述生长因子和相应的生长因子受体信号传导。术语“生长因子受体的组成型活性变体”涉及即使在没有它们相应的生长因子配体的情况下也处于激活状态的生长因子受体变体。在优选的实施方案中，编码生长因子受体的组成型活性变体的基因和GOI存在于同一载体上。合适的载体没有特别限制并且是本领域已知的。在具体实施方案中，生长因子受体和相应的生长因子是IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)、IR(胰岛素受体)和IGF-1、IGF-2和/或胰岛素；EGFR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：/n(a)提供细胞系，/n(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：/n(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子，以及/n(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及/n(c)在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170808 EP 17001356.91.选择表达一种或多种目的蛋白(POI)的稳定生产细胞系的方法，其包括以下步骤：
(a)提供细胞系，
(b)同时稳定转染所述细胞系，所述细胞系具有：
(i)编码生长因子受体的组成型活性变体的基因，其中在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下，所述细胞系的生长取决于由所述生长因子受体识别的生长因子，以及
(ii)编码所述POI的一种或多种目的基因(GOI)，以及
(c)在细胞培养基中培养所述细胞系，所述细胞培养基或者不包含由所述生长因子受体识别的生长因子，或者在不表达所述生长因子受体的组成型活性变体的情况下包含浓度低至无法支持细胞生长的所述生长因子。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞系选自CHO细胞、HEK293细胞、CAP细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、Vero细胞、MDCK细胞、杂交瘤细胞和成纤维细胞。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述POI选自细胞外基质蛋白、生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子、蛋白酶抑制剂和病毒蛋白产物。


4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述POI选自人重组α-1-抗胰蛋白酶(rhAAT)，纤维蛋白原，层粘连蛋白(LAM)，干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，双特异性单克隆抗体(BsAb)，促红细胞生成素(EPO)，凝血因子VII(FVII)，凝血因子VIII(FVIII)，凝血因子IX(FIX)，von-Willebrand因子(vWF)，C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1Inh)，来自HIV-1、HIV-2、EIAV、SIV或其他逆转录病毒科(gag-pol)的gag-pol，来自腺相关病毒的rep蛋白(REP)，来自腺相关病毒的cap蛋白(CAP)及其变体。


5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述编码生长因子受体的组成型活性变体的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：妮可·佛斯特，西尔克·维辛，尼古拉·施特伦佩尔，
申请(专利权)人：塞维克制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE