具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物制造技术

本发明专利技术涉及包含具有β‑半乳糖苷酶活性的多肽的组合物，特别是液体组合物；制备所述组合物的方法；以及这些组合物用于制备例如乳制品的用途。这些具有β‑半乳糖苷酶活性的多肽是通过如下方式来修饰：通过将该酶在还原糖的存在下孵育来糖化赖氨酸和/或精氨酸残基，任选地结合热处理。由此，提高了转半乳糖基活性。

Glycosylated \u03b2 - galactosidase composition with improved galactosylation activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改进的转半乳糖基活性的糖基化β-半乳糖苷酶组合物序列表本专利技术包含序列表，将其通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及包含酶的组合物，特别是液体组合物；制备这些组合物的方法；以及这些组合物用于制备例如乳制品的用途。专利技术背景β-半乳糖苷酶也称为乳糖酶，它是已知可水解β-D-半乳糖苷酶中的末端非还原性β-D-半乳糖残基的酶。更特别地，在正常反应条件下，该酶将其乳糖底物水解成单糖组分D-葡萄糖和D-半乳糖。在某些条件下，某些β-半乳糖苷酶具有在称为转半乳糖基(transgalactosylation)的过程中将半乳糖转移至葡萄糖或半乳糖的羟基基团以形成低聚半乳糖(GOS)的能力。已经描述了具有高转半乳糖基活性的来自两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)的乳糖酶，全长形式的和特别是从C-末端截短的均有描述(参见例如等人(2001),Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术],57:647-652或EP专利1283876)。在WO2009/071539中，我们描述了与相比不同的截短片段。WO2009/071539披露了来自两歧双歧杆菌的胞外乳糖酶的C-末端截短片段，其由于能由乳糖得到大量低聚半乳糖的能力而最初得到分离并请求专利保护，能非常成功地用于水解乳中的乳糖。当在37℃下在水+100g/l乳糖中测试时，如该现有技术所述，该酶高效地制备低聚半乳糖。然而，当在乳中测试时，水解活性与转半乳糖基活性的比率发生明显变化，导致高效水解和极低产量的低聚半乳糖。WO2013/182686还描述了与相比的不同截短片段，该截短片段被描述为：当与乳糖一起孵育时，即使在低乳糖水平下(如在乳基产品中)，该截短片段也是GOS的高效生产者。WO2013/182686还描述了包含稳定剂的组合物。WO2015/132349描述了液体乳糖酶组合物，其包含乳糖酶，并且还包含钠、钙或钾-L-乳酸盐或其组合以及任选的糖。仍然需要开发作为GOS的高效生产者的酶及其工业上重要的配制品。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术提供了配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖。在另一个实施例中，本专利技术提供了具有β-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。在另一个实施例中，本专利技术提供了修饰具有β-半乳糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括使该多肽与还原糖，优选果糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。在另一个实施例中，本专利技术提供了用于产生低聚半乳糖(GOS)的方法，该方法包括使本专利技术的配制品或本专利技术的多肽或已经通过本专利技术的方法修饰的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽与乳糖接触。在再另一个实施例中，本专利技术提供了用于产生低聚半乳糖的方法，该方法包括在高温和高初始乳糖浓度的条件下使具有包含SEQIDNO:1的氨基酸1-1304或由其组成的序列的多肽与乳糖接触。具体实施方式尽管某些β-半乳糖苷酶或乳糖酶具有主要的水解特性，但是这些酶在例如高乳糖和高温条件下可以被迫具有转移特性。我们出人意料地发现，当进行预孵育时先前水解作用为主的酶可以转化为转移酶，该酶与未加工的酶相比还能够在更低的温度下高效地制备GOS。因此，预孵育出人意料地导致了更稳健的产生GOS的酶，这是由于该酶增强的转移能力(转半乳糖基酶活性)所致。不希望受理论的束缚，认为这些孵育条件导致β-半乳糖苷酶的糖化，这导致增加的转移特性。随着糖部分的共价附接，β-半乳糖苷酶从水解酶转化为具有转半乳糖基酶活性的转移酶。β-半乳糖苷酶来自糖苷水解酶家族2(GH2)的β-半乳糖苷酶是具有外切作用的酶，其水解β-D-半乳糖苷中的末端非还原性β-D-半乳糖残基，例如将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。它们属于酶类别EC3.2.1.23，官方名称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。此酶的常用名称是乳糖酶，因为乳糖是常见的工业底物。除水解外，此酶类别还能够将半乳糖转移至其他糖类，从而制备低聚半乳糖(GOS)。不同的GH2酶对水解或β-半乳糖苷酶活性和转半乳糖基酶活性具有不同的偏好，并且该偏好可以由其GOS产生能力来表示，例如由转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率来表示。在本上下文中，术语“β-半乳糖苷酶”意指具有将二糖乳糖水解成其成分半乳糖和葡萄糖单体的能力的任何糖苷水解酶。指定为亚类EC3.2.1.108的酶也称为乳糖酶，其在本专利技术的上下文中也被认为是β-半乳糖苷酶。在本专利技术的上下文中，该β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性可以被称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。在本专利技术的上下文中，具有β-半乳糖苷酶活性的多肽优选属于酶类别3.2.1.23或EC3.2.1.108，优选3.2.1.23。具有β-半乳糖苷酶活性的多肽优选属于糖苷水解酶家族2(GH2)、更优选属于糖苷水解酶家族GH2_5。在某些应用中，可以考虑主要具有转半乳糖基活性和主要具有水解活性的多肽的组合。当需要在用具有β-半乳糖苷酶活性的多肽处理(例如在低乳糖水平下)后减少残留的乳糖时，这可能尤其有用。当考虑在例如乳中的多肽的反应时，碳水化合物最初以乳糖的形式存在，该乳糖是在乳中发现的由半乳糖和葡萄糖构成的二糖。在GOS的形成中，连续的半乳糖分子被添加至乳糖中，然后在延长的孵育后，存在各种碳水化合物(葡萄糖、半乳糖和约30种不同的二糖和多糖)的混合物。如本文所用的术语“二糖”意指通过称为糖苷键的共价键结合在一起的两个单糖单元，该糖苷键经由脱水反应形成，从而导致一个单糖失去氢原子而另一个单糖失去羟基基团。在一方面，该二糖是纤维二糖、岩藻糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、鼠李糖或蔗糖，最优选乳糖。如本文所用，术语“转半乳糖基酶”意指能够将半乳糖转移至D-半乳糖(Gal)或D-葡萄糖(Glc)的羟基基团从而产生低聚半乳糖的酶。在一个实施例中，通过该酶对乳糖的反应来鉴定转半乳糖基酶活性，其中在给定时间产生的半乳糖的量少于产生的葡萄糖的量。更特别地，可以将转半乳糖基酶活性或对于用以水解乳糖或产生GOS的酶的偏好评价为在反应期间的任何给定时间产生的葡萄糖减去半乳糖的量，或者通过直接定量反应期间产生的GOS来评价。可以通过包括本文实例中所示的方法在内的几种方式中的一种来进行此测量。当评价酶的转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性时，β-半乳糖苷酶活性被测量为在反应期间的任何时间点产生的半乳糖浓度。在本上下文中，多肽的GOS生产被测量为即，转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率。优选地，转半乳糖基活性与β-半乳糖苷酶活性的比率为至少1、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12，如在高乳糖条件下测量的。根据本专利技术有用的具有β-半乳糖苷酶活性的多肽可以是动物、植物或微生物来源的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖；其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170515 EP 17171174.0;20180316 EP 18162193.91.一种配制品，其包含具有β-半乳糖苷酶活性的多肽和至少30wt％的还原糖，优选果糖、半乳糖、葡萄糖或乳糖；其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。


2.如权利要求1所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽已经通过该多肽的至少1％、优选至少3％、更优选至少5％的赖氨酸和精氨酸残基的糖化而被修饰。


3.如权利要求1或2中任一项所述的配制品，其具有200-20,000LAU(C)/g的活性。


4.如权利要求1-3中任一项所述的配制品，其为液体配制品，并且优选具有200-15,000LAU(C)/g、更优选500-10,000LAU(C)/g的活性。


5.如权利要求1-4中任一项所述的配制品，其包含40wt％-65wt％糖，其中该糖优选为葡萄糖。


6.如权利要求1-5中任一项所述的配制品，其基本上不含甘油，并且还任选地包含氯化钠或氯化钾，该氯化钠或氯化钾优选在0.01wt％-5wt％、优选0.01wt％-3wt％、更优选0.01wt％-2wt％的范围内。


7.如权利要求1-6中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:5或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:6或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:7或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:8或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:9或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:10或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:11或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:12或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:13或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:14或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与SEQIDNO:15或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。


8.如权利要求1-7中任一项所述的配制品，其中该具有β-半乳糖苷酶活性的多肽具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸1-1304或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:2的氨基酸28-1931或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:3的氨基酸28-1331或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与SEQIDNO:4或其具有β-半乳糖苷酶活性的片段至少50％...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·塔姆斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK