一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用，包括以下步骤：(1)传统

Preparation and application of a porous PVDF template geometrically constrained immune bead composite

【技术实现步骤摘要】
一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用
本专利技术涉及生物化学
，特别是涉及一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用。
技术介绍
临床上，测定C肽的浓度能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有重要的意义。C肽商业化的免疫测定方法是通过C肽免疫反应活性来测定C肽浓度，但是通常会出现检测值偏高的情况。同位素稀释质谱法时能够区别内源和外源蛋白质，从而能直接准确的测定目标物质。日本计量院将6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)修饰C肽N端氨基，氨基喹啉基可以通过在肽段中添加正电荷来提高电离效率，化学修饰和磁珠免疫提取法提高了血清中C肽的定量限，其柱上0.003～2.9ng范围内线性关系良好，相对标准偏差为4.0％，加入NMIJCRM6901-b作为标准物质，提供了一种潜在的C肽标准测量程序，但是该方法流程复杂，会影响结果准确度。目前在同位素稀释质谱法的样品前处理中，蛋白质类样品通常是通过抗原和抗体免疫结合进行分离，其特异性和高效性为提取低丰度复杂基质中样品提供了便捷途径。因此将具有超顺磁性物质的表面包覆不同的官能团与抗体或抗原进行共价或非共价结合，既可以发挥抗原抗体的特性结合优势，又可以发挥超顺磁性物质的特点，通过磁场的改变达到混合均匀、高效分离和基质残留量少的目的。目前的研究都集中在建立颗粒表面功能化和探索固定抗体最优方法方面，以达到特异性富集和获得最佳提取效率的目的。由于磁性粒子可以用不同的合成方法来制备，它们的大小和理化性质有很大的差异，这限制了对抗体可靠结合能力的预测。因此，定量控制颗粒的可变性和功能化，开发通用的分析方法来准确定量结合抗体的数量是非常重要的。Dynabeads免疫磁珠是一种均匀无孔、超顺磁性、单分散和高度交联的聚苯乙烯微球，由均匀分散的γ-Fe2O3和磁铁矿(Fe3O4)的混合物组成。磁珠因有超强的顺磁性，具有能够在磁场中迅速聚集固定和离开磁场后又能迅速均匀分散的特点。同时，微纳米级别的磁珠比表面积高，沉降速率极低，在包覆丰富的官能团之后，能够应用到各种物质的提取和富集中。与传统的分离方法相比，Dynabeads免疫磁珠孵育时间短、可以使生化样品复杂组分的分离和富集同时进行，实验结果背景干扰少、重现性好。免疫磁珠的无孔结构在一定程度上能降低杂质的捕获能力，减少抗体的消耗，但是在提取血清基质中蛋白质，尤其是低丰度蛋白时，提取后的剩余基质中依然可以检测到大量剩余目标蛋白的存在，说明磁珠在提取过程中富集效率有限，远远没有达到理想状态。另外磁珠粒径的不均一化可能会阻碍部分免疫磁珠定位到磁铁而造成实验中目标蛋白的丢失。同时在前处理过程中，低丰度样品的浓度越低往往需要的磁珠量越多，因此磁珠和抗体的添加量都是远远过量的，造成了极大的浪费。因此本专利技术从增加抗体和抗原的接触面积，确定抗原和磁珠的接触方向为出发点制备多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠的复合材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，具体为：(1)传统法制备单分散SiO2微球：将3.6mL水、10mL氨水、甲醇：异丙醇＝1：3(10mL，30mL)混合搅拌加热至40℃，缓慢逐滴加入0.6mL正硅酸乙酯(TEOS)，转速为300rpm，搅拌反应30min，得到硅球种子溶液，然后再缓慢滴加3.4mLTEOS，继续反应2h，在通风橱放置5h除去多余氨。离心后去离子水和乙醇各洗涤两次，40℃干燥备用。样品加入无水乙醇中超声分散2h，室温干燥后在30％过氧化氢中浸泡12h，真空干燥后备用。(2)丁二酸改性：将0.5gSiO2溶于25mL乙腈中，超声振荡后形成均匀的分散溶液。在三口烧瓶中加入1.5g丁二酸，25mL乙腈，连续搅拌回流加热至60℃，加入5mL去离子水直到丁二酸完全溶解，再将分散溶液倒入三口烧瓶中，继续搅拌回流升温至75℃。连续搅拌保温24h后将产物冷却到65℃左右，热抽滤后用去离子水和无水乙醇的混合溶液洗涤三次，60℃干燥备用。(3)浸渍SiO2微球：将载玻片在使用前用质量分数为30％的过氧化氢和质量分数为98％的浓硫酸的混合溶液中(体积比3:7)浸泡静置12h，再经去离子水反复漂洗后在氮气流中干燥备用。用去离子水配成质量分数为2％SiO2分散溶液，超声分散转移至染色缸中。将处理后的载玻片插入染色缸中垂直置于悬浮液中，真空干燥后取出载玻片。(4)多孔PVDF膜的制备：将2gPVDF粉末溶解在10mL二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，滴适量在SiO2浸渍后的载玻片上，保持均匀，在60℃烘箱中干燥6h，取出后浸泡在去离子水中，膜自动与载玻片分离。配置刻蚀液1ml乙醇、1mL氢氟酸和5mL去离子水，将得到的膜浸泡在刻蚀液中5天，刻蚀后的PVDF膜用大量去离子水冲洗。(5)多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料的制备：将免疫磁珠悬浮在涂层缓冲液中，把刻蚀SiO2后的PVDF膜浸泡在其中，室温振荡孵育5h，取出制备好的组装磁珠膜材料，冲洗表面残留磁珠。其中，实验所用磁珠表面的官能团为对甲苯磺酰基，可以与抗体上的氨基发生二级亲核取代反应，使磁珠可以通过共价键偶合不同抗体，并且产生等摩尔质量的对甲苯磺酸。本专利技术制备的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料在C肽定量上的应用：准确称取500μL血清样品，按免疫法测得的C肽浓度加入等质量C肽标记物，准确称量、混匀；将制备好的模板分散免疫磁珠复合材料与抗体偶合，加入50μL磁珠-抗体复合物，室温下混匀一小时，结合了目标物的磁珠以1mLTBST洗涤三次，再用1mLTBS洗涤一次；最后用100μL0.1％三氟乙酸水溶液将磁珠上结合的C肽收集下来，上机检测。同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：本专利技术从提高C肽提取源头效率出发，使其能够不通过衍生化处理就可以进一步提高方法定量限。从增加抗体和抗原的接触面积，确定抗原和磁珠的接触方向为出发点，制备了多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠的复合材料。将制备的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料应用于C肽定量限考察，通过与未分散免疫磁珠对比，用多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料提取C肽纯品后将定量限由柱上0.3ng降低至0.05ng，与日本计量院发表的C肽潜在参考测量程序相比，不通过衍生化处理后就能达到定量正常人血清C肽的目标，简化了检测流程，同时减少了磁珠和抗体的用量。下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法及应用作进一步说明。附图说明图1中，(a)为磁珠偶合抗体反应机理；(b)为制备方法原理示意图；图2中，(a)为对甲苯磺酸液相色谱图；(b)为对甲苯磺酸线性拟合图；图3中，(a)丁二酸改性二氧化硅；(b)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)传统

【技术特征摘要】
1.一种多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)传统法制备单分散SiO2微球；
(2)丁二酸改性；
(3)浸渍SiO2微球；
(4)多孔PVDF膜的制备：
将2gPVDF粉末溶解在10mL二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌均匀，滴适量在SiO2浸渍后的载玻片上，保持均匀，在60℃烘箱中干燥6h，取出后浸泡在去离子水中，膜自动与载玻片分离；配置刻蚀液1ml乙醇、1mL氢氟酸和5mL去离子水，将得到的膜浸泡在刻蚀液中5天，刻蚀后的PVDF膜用大量去离子水冲洗；
(5)多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料的制备：
将免疫磁珠悬浮在涂层缓冲液中，把刻蚀SiO2后的PVDF膜浸泡在其中，室温振荡孵育5h，取出制备好的组装磁珠膜材料，冲洗表面残留磁珠。


2.根据权利要求1所述的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，将3.6mL水、10mL氨水、10mL甲醇、30mL异丙醇混合搅拌加热至40℃，缓慢逐滴加入0.6mL正硅酸乙酯TEOS，转速为300rpm，搅拌反应30min，得到硅球种子溶液，然后再缓慢滴加3.4mLTEOS，继续反应2h，在通风橱放置5h除去多余氨；离心后去离子水和乙醇各洗涤两次，40℃干燥备用；样品加入无水乙醇中超声分散2h，室温干燥后在30％过氧化氢中浸泡12h，真空干燥后备用。


3.根据权利要求2所述的多孔PVDF模板几何约束免疫磁珠复合材料制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，将0.5gSiO2溶于25mL乙腈中，超声振荡后形成均匀的分散溶液；在三口烧瓶中加入1.5g丁二酸，25mL乙腈，连续搅拌回流加热至60℃，加入5mL去离...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋德伟，职承瑶，李红梅，肖鹏，李志林，刘健仪，马凌云，王馨雪，朱文，孙浩峰，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11