MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法技术

本发明专利技术公开了一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，所述方法选择不含增强子且在转录起始位点上含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换pEGFP‑C1载体上的CMV启动子，构建中间载体，在中间载体的Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达；本发明专利技术所述方法可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗的表达载体构建，提高生产效率，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效益。

Construction of efficient expression vector with weak promoter regulated by Mar sequence

【技术实现步骤摘要】
MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法
本专利技术属于生物
，涉及用于重组抗体或蛋白药物生产等的表达载体及其构建方法，尤其涉及一种利用MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法。
技术介绍
重组治疗性抗体、疫苗或蛋白药物（统称重组药）是重大疾病如癌症、类风湿关节炎、乙型肝炎和艾滋病等疾病的有效药物，这些重组药应用于市场主要存在的问题是研发和生产成本很高，导致药品价格昂贵，因此降低研发和生产成本是重组药生产的迫切需求。重组药细胞株筛选的复杂性和生产过程中表达量下降即生产细胞株不稳定的现象，是研发和生产中的主要障碍，其关键环节在于构建稳定高效表达载体。表达载体在不同的细胞系中因整合位置和表观遗传因素引起的转基因沉默是影响重组药稳定高产的主要原因。其中表观遗传机制导致的生产不稳定尤其复杂和难以捉摸，这些表观因素包括组蛋白修饰(低乙酰化)、DNA甲基化和染色质重塑等。通常情况下细胞表达载体的表达框中启动子常常选择启动效率高的强启动子，但是强启动子易受宿主细胞自我保护机制的抵抗，在启动子区域及关联基因附近形成阻碍基因表达的染色质修饰和染色质三维结构改变。因此克服和避免强启动子区域的染色质三维结构变化导致的表观抑制是表达载体高效和稳定表达的关键。现有技术中主要用染色质调节元件如MARs（Matrixattachmentregions，MARs)克服强启动子的沉默效应从而获得较高表达，但却未关注到调节区域染色质三维结构的改变对表达载体表达能力的综合影响。MAR序列是最早认为能将基因组在拓朴结构上分隔为不同结构域的DNA元件（Phi-VanL,1996）；MAR序列能将转基因与周围的基因组的负面作用隔绝开（绝缘功能），因此能克服转基因位置效应(Seibler,etal,2005；McKnight,etal,1992)，能增强基因转录效率(Bode,etal,2000)；MAR序列还能通过阻碍DNA甲基化支持组蛋白乙酰化维持长期的高转录水平(Dang,etal,2000；Kurre，etal,2003)。可是，MARs与弱启动子结合时对表达量调控的解决方案却未见报道。通过对基因工程中常用的真核生物强启动子特征进行分析，发现在TSS（转录起始位点）附近存在许多转录调控元件参与染色质的表观调节，这些元件是主动调节关联启动子区域染色质重塑的DNA序列。其中，增强子和CpG岛尤其重要。增强子以不同的方式影响组蛋白H3上的第4个赖氨酸（K4）、第9个赖氨酸（K9）和第36个赖氨酸（K36）的组蛋白甲基化。在增强子连接的基因编码区所有三个赖氨酸残基都高度三甲基化，而K9和K36的二甲基化不受增强子的影响；在增强子区域只在K4和K9处出现单甲基化，有别于基因编码区的组蛋白甲基化修饰。CpG岛会有选择性地募集大量染色质，CpG岛区染色质常常形成半胱胺酸甲基化缺失、低水平的组蛋白H1、高水平的组蛋白乙酰化及等无核小体区域的DNaseI高敏感性位点（Wang,B.,J.Sun,etal.(2016)."Small-ActivatingRNACanChangeNucleosomePositioninginHumanFibroblasts."JournalofBiomolecularScreening21(6):634-642；Wangbin,HuYunzhang(2017).Promoter-targetedsmallactivatedRNAsalternucleosomepositioning,,RNAactivation,SpringerNature,Chapter6）。相比之下，弱启动子则通常不含增强子，但弱启动子上可能存在CpG岛。现有技术中还未见有MAR序列与特定类型弱启动子结合提高表达能力的报道，也没有关于利用MAR序列与弱启动子共同作用形成更有利于克服启动子区域稳定的开放染色质三维结构层面的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中未见采用MAR序列与弱启动子结合构建表达载体应用于重组药等相关领域，提供一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，所构建的表达载体能持续稳定高效表达32天以上，以满足工业上的生产和推广使用。为了解决以上所述技术问题，本专利技术所述MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法包括以下步骤：（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游AseI酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。进一步，本专利技术所述靶启动子为人源SOX2基因启动子。进一步，本专利技术所述构建中间载体步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT(AseI)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGACSOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(AgeI)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。哺乳动物细胞表达载体整合到宿主细胞基因组后，由于受整合位置染色质重塑蛋白或其它各种表观修饰因素的影响，导致表达载体出现表达被抑制的转基因沉默现象。对转基因沉默的机制一般认为受表观修饰的影响，但由于表观修饰复杂多样，很难一概而论，因此需要从更为宏观的层面来理解转基因沉默的机制，即染色质的三维结构。一般认为染色质三维结构无致密核小体覆盖时，该位点的基因转录或表达激活；如果染色质在三维结构上被核小体紧密覆盖，该位点的基因转录沉默。自然状态下，基因组上有些位置总是处于易被DNA酶Ⅰ可以切割的敏感区域，而有些位置则不能用DNA酶进行切割，这表明因DNA序列的不同导致该区域被染色质保护的程度不同，因此DNA序列对染色质三维结构的调节发挥重要作用。以往的研究表明，能调节染色质结构的DNA序列包括染色质调控元件如MAR序列和UCOE序列等；另外，启动子上的调节元件如CpG岛和增强子等序列也会影响染色质重塑进而影响染色质的三维结构。已报道的技术中，将MAR序列与某些启动子相连时能克服沉默效应，上调基因的表达。但是关于MAR与何种启动子能建立更稳定更高效表达载体的问题仍未解决。本专利技术所述靶启动子属于弱启动子，是指不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子；所述CpG岛指CG含量在全部DNA序列碱基中≥60%；CG即二核苷酸。本专利技术是通过靶启动子（如SOX2基因启动子）上参与染色质调节CpG岛与MAR序列共同作用建立更有利于MAR形成染色质隔离区域的推断，得到的一种新的构建高效表达载体的方法，证明MAR序列与靶启动子上转录起始位点位置CpG岛共同作用时能获得大于含增强子的强启动子的表达效率。本专利技术所述方法的主要作用机制为MAR和靶启动子的CpG岛共同作用改变启动子附近染色质三维结构，形成稳定开放染色质或其它适合于转录的结构。本专利技术的有益效果：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；/n（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；/n（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游AseI酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。


2.根据权利要求1所述MAR序列调控弱启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，刘凌云，范志伟，殷旭东，王德斌，王定康，
申请(专利权)人：昆明学院，
类型：发明
国别省市：云南;53