一种降低乳糖含量的牛奶制作方法技术

本发明专利技术公开了一种降低乳糖含量的牛奶制作方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术利用了耐热的硫矿硫化叶菌的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)可以耐受80℃以上高温的特性，通过乳腺生物反应器生产外源蛋白的技术将该基因序列进行密码子优化后的lacs基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达，使生产出的牛乳含有乳糖分解酶，经常规加热消毒后牛乳中的乳糖被降解，含量下降。此方法具有成本低、产量稳定、安全高效等优点，对于工业制备低乳糖牛奶具有颠覆性的意义。

A method to reduce lactose content in milk

【技术实现步骤摘要】
一种降低乳糖含量的牛奶制作方法
本专利技术涉及一种降低乳糖含量的牛奶制作方法，属于基因工程

技术介绍
乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少、不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻，又被称乳糖酶缺乏症。乳糖酶缺乏是广泛存在的世界性问题，远东人群发生率高，大部分人群不出现症状，但在以乳汁为主要饮食的新生儿及婴幼儿中常发生腹泻等症状。根据FoodIntoleranceNetwork公布的调查结果，95％的亚洲人经受着乳糖不耐症的困扰。普通牛奶中乳糖含量占4.2％，而乳糖不耐症的人群因为缺乏乳糖分解酶无法完成乳糖的降解和吸收。不能降解的乳糖就会被肠道微生物作为碳化合物进行发酵产酸产气，从而导致胃肠失调，并造成有价值的蛋白质和矿物质的损失。此外，乳糖吸收不良还会影响到对牛乳中铁、锌、钙等矿物质元素的吸收。目前降低牛奶中乳糖含量的方法主要有发酵成酸奶、过筛法或通过对原料乳进行巴士杀菌后加乳糖水解酶水解乳糖的方法。发酵方法改变了牛奶的风味，过筛法获得的牛奶主要制成奶粉，在市场上销售价格较高，而巴士杀菌后加酶的方法存在能耗高、生产效率低等问题。动物乳腺生物反应器是利用利用乳腺特异性调控元件指导外源基因在乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产重组蛋白。其基本原理是应用DNA重组技术和转基因技术，将目的基因转移至尚处于原核阶段的受精卵或1-2细胞期的动物胚胎中，经胚胎移植，得到转基因乳腺表达个体，通过收集乳汁来获得目的基因表达产物。动物乳腺生物反应器是目前研究最多、应用最为广泛的动物生物反应器，备受各国科学家的关注。乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛、优势明显。首先，动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性；其次，动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，该方法的目的蛋白易分离提纯、成本低廉、产量高。利用乳腺生物反应器大量生产蛋白质的方法应用很普遍，但由于载体较大会降低转染效率，基因整合到基因组上的效率较低，因此目前还没有利用奶牛乳腺生物反应器生产乳糖分解酶的研究出现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种降低乳糖含量牛奶的制作方法，是将外源基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达，使生产出的牛乳含有乳糖分解酶，具体包括以下步骤：(2)转染：将含外源基因的特异性表达载体转入来源于奶牛胎儿皮肤组织的细胞系；(3)筛选转染成功的细胞系，扩大培养；(4)利用克隆方法生产携带外源基因的奶牛，产乳；(5)75-100℃下加热牛乳。所述外源基因是对来自硫矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus，P2)的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)序列进行密码子优化得到的lacs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述lacs基因导入动物体后特异表达部位在乳腺。在本专利技术的一种实施方式中，所述特异性表达载体是以pMD19-T载体框架表达lacs基因，该特异性表达载体上还包括β-酪蛋白启动子、TALEN酶切识别位点及其微同源位点。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述的细胞系为来源于奶牛胎儿皮肤组织的可以连续传代15代，细胞周期和核型分析正常，且活力良好的成纤维细胞系。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述的转染，电压设置为175-200V。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(5)是在75-100℃下加热牛乳。本专利技术另一个目的是提供一种以pMD19-T载体为框架，目的基因为核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的lacs基因的基因表达载体及其在乳制品制备中的应用。本专利技术利用了耐热的硫矿硫化叶菌的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)可以耐受80℃以上高温的特性，通过乳腺生物反应器生产外源蛋白的技术将该基因序列进行密码子优化后的lacs基因转染到牛的乳腺细胞进行特异性的表达，使生产出的牛乳含有乳糖分解酶，经常规加热消毒后牛乳中的乳糖被降解，含量下降。此方法具有成本低、产量稳定、安全高效等优点，对于工业制备低乳糖牛奶具有颠覆性的意义。附图说明图1：TALEN质粒图谱(携带CMV启动子，Sp6体外转录启动子)；图2：lacs基因特异性表达载体框架；图3：产物1～5的PCR鉴定电泳图；模板为扩大培养后的细胞，目的产物为lacs基因的部分片段；鉴定引物P3、P4；目的片段长度约560bp；M:100bpladdermarker；图4：产物6～11的PCR鉴定电泳图；模板为扩大培养后的细胞，目的产物为lacs基因和细胞基因组插入位点下游部分序列；鉴定引物P3、P2；目的片段长度约900bp；M:100bpladdermarker。具体实施方式实施例1：TALENs及lacs基因载体构建(1)合成lacs基因序列首先利用PCR技术扩增硫矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus，P2)的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)(NCBI编号：AF133096)。PCR引物：P1序列如SEQIDNO.2所示；P2序列如SEQIDNO.3所示，预期产物为长度1490bp。测序后根据牛的密码子偏好优化密码子序列，人工合成lacs序列，如SEQIDNO.1所示。(2)构建TALEN载体TALEN载体构建按照试剂盒说明书进行，拼接的TALEN识别DNA长度为11-18bp。采用T7E1酶切法检测TALEN质粒活性，TALEN载体选用携带哺乳动物细胞通用的CMV启动子以及Sp6体外转录启动子，如图1所示，可以用于体外mRNA转录。采用在线网站http://www.e-talen.org/E-TALEN设计插入位点，序列如SEQIDNO.4所示。序列的第18-33位为间隔序列。(3)lacs基因载体构建在lacs基因的5'端添加β-酪蛋白启动子，得到一个长约4.4kb的lacs-β-酪蛋白启动子片段。以该片段为模板进行PCR扩增，引物两端分别添加TALEN识别位点和微同源序列。微同源区域为8bp。lacs基因在牛基因组上的插入位点选择β-酪蛋白第二内含子区域，在lacs基因整合进牛基因组的过程中，可以实现一对TALEN同时切割基因组靶位点与lacs基因片段上的识别位点，剔除克隆载体骨架，以实现外源基因的无痕敲入。PCR引物：lacsPF序列如SEQIDNO.5所示；lacsPR序列如SEQIDNO.6所示。其中lacsPF和lacsPR序列的第1-18位为TALEN识别序列，第27-34位为微同源区域。PCR体系：GXLpolymerase：1μL；5×GXLBuffer：10μL；dNTPs：4μL；上下游引物各1μL；模板质粒(30ng/μL)：1μL；ddH2O：补至50μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，61℃1min，72℃5min；72℃10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低乳糖含量的牛奶制作方法，其特征在于，具体包括以下步骤：/n(1)构建外源基因特异性表达载体，所述外源基因是编码糖苷酶的基因；/n(2)转染：将含外源基因的特异性表达载体转入来源于奶牛胎儿皮肤组织的成纤维细胞系；/n(3)筛选转染成功的细胞系，扩大培养；/n(4)利用步骤(3)筛选得到的细胞系克隆得到携带外源基因的奶牛，饲养奶牛使奶牛产乳；/n(5)加热牛乳。/n

【技术特征摘要】
1.一种降低乳糖含量的牛奶制作方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)构建外源基因特异性表达载体，所述外源基因是编码糖苷酶的基因；
(2)转染：将含外源基因的特异性表达载体转入来源于奶牛胎儿皮肤组织的成纤维细胞系；
(3)筛选转染成功的细胞系，扩大培养；
(4)利用步骤(3)筛选得到的细胞系克隆得到携带外源基因的奶牛，饲养奶牛使奶牛产乳；
(5)加热牛乳。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因是对来自硫矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)的嗜热菌糖苷酶基因(LacS)序列进行密码子优化得到的lacs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘羿羿，吴耀，张东，荆文魁，张立，苏小虎，张焱如，李璐，王申元，周欢敏，曹俊伟，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，内蒙古高原基因研发中心，呼和浩特市第一医院，
类型：发明
国别省市：内蒙;15