一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段。本发明专利技术的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

A highly efficient siRNA producing tobacco mosaic virus gene fragment, attenuated vaccine, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用
本专利技术属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。
技术介绍
病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。烟草病毒病一直是制约我国烟叶生产的重要因素。目前生产上的烟草主栽品种对病毒病的抗性都不理想，烟草病毒病的防治主要依赖农业防治和化学防治。但生产中没有针对病毒病的特效药剂，通过杀灭传毒昆虫来防治烟草病毒病的效果很差，而且农药的大量应用也不符合烟叶生产可持续发展的要求。利用弱毒株系保护植物免受强毒株系的侵染和危害(交叉保护)是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。最近几年，交叉保护受到了越来越多的关注。植物可利用RNA沉默来抵抗病毒侵染，病毒侵染植物后会产生大量病毒来源的小RNA(virus-derivedsmallinterferingRNAs,vsiRNA)，介导对病毒RNA的降解或抑制病毒基因的转录。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是一是目前可用的弱毒株系种类不多，应用不方便，二是已发现的弱毒株系都是自然存在或人工诱变产生的，可能只在个别甚至是一个氨基酸位点发生了突变。这些弱毒株系或突变体在用于防治病毒病时有突变为强毒株系的风险。烟草花叶病毒(TMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，分布范围和寄主范围均十分广泛，能侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物，形成疱斑或花叶症状，严重影响作物产量及品质。TMV与黄瓜花叶病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，造成更大损失。田颖川、方荣祥报道获得转基因抗TMV工程植株，田波、陈章良也分别把从TMV-CP基因及卫星RNA导入到烟草品种NC89、C-28中，创造出抗TMV的转基因烟草，但因为转基因烟草受限而不能推广种植。杨恭、邵碧英筛选到TMV弱毒株系N14、TMV-152，并开发成弱毒疫苗，但因为接种和扩繁不便未能推广使用。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的稳定的弱毒疫苗来防治植物的病毒病。有鉴于此特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。本专利技术获得了序列保守且能够高效脱靶产生siRNA的TMV片段，抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。为解决上述技术问题，本专利技术采用技术方案的基本构思是：本专利技术的第一目的是提供一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如SeqIDNo.13、SeqIDNo.14、SeqIDNo.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。本专利技术的第二目的是提供一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段。进一步的方案，可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如SeqIDNo.13、SeqIDNo.14、SeqIDNo.15所示。进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV1或TMV3片段。进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV3片段。本方案以自主构建的烟草脉带花叶病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV)突变体为基础，该突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。通过RT-PCR、酶切连接技术将烟草花叶病毒(TMV)的不同基因片段连入TVBMV突变体获得嵌合体病毒，也就是弱毒疫苗。然后将弱毒疫苗接种植物，接种15天后再用烟草花叶病毒(TMV)强毒株系侵染植物。结果意外地发现携带TMV的TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的弱毒疫苗可减轻烟草发病，尤其是TMV3片段交叉保护的效果更好，可以减轻植株感染病毒病后的损失。进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体包括烟草脉带花叶病毒HN39的基因组，基因组的5’末端连接有35S启动子；且基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有突变，至少第52位的精氨酸突变为谷氨酸。利用反向遗传学技术，明确了TVBMV中的HC-Pro调控TVBMV致病力、协生和抑制RNA沉默的氨基酸。并在这些位点引入突变，获得了含有多个氨基酸突变、不能蚜传、与TMV无协生作用的TVBMV弱毒突变体。这些突变体不易发生回复突变，使用安全，对野生型TVBMV有良好的交叉保护效果。进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第198位的天冬氨酸突变为赖氨酸。进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。本专利技术的第三目的是提供一种如上任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)构建TVBMV弱毒突变体；(2)获得可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的烟草花叶病毒基因片段TMV1或TMV2或TMV3；(3)将得到的TMV1或TMV2或TMV3基因片段插入TVBMV弱毒突变体，获得弱毒疫苗。进一步的方案，以烟草花叶病毒的基因组为模板，利用PCR技术扩增得到TMV1或TMV2片段或TMV3，然后分别插入到TVBMV弱毒突变体的多克隆位点中，获得含有各基因片段的弱毒疫苗。本专利技术的第四目的是提供一种含有如上任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的重组菌；优选的，所述的重组菌包括转入了弱毒疫苗的农杆菌。本专利技术的第五目的是提供一种如上所述的高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，或者任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗在防治烟草花叶病毒强毒株系侵染植物方面的应用；优选的，所述的植物为双子叶植物；优选的，所述的植物为烟草。本专利技术的弱毒疫苗的制备及应用的具体过程包括：a.TMV片段的筛选：经过Bioedit比对及siRNADirect筛选，得到TMV1、TMV2和TMV3三个保守且高效产生smallRNA的片段。b.片段克隆及载体构建：PCR扩增片段后使用酶切连接将目的片段连接到烟草脉带花叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，其特征在于，高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，其特征在于，高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如SeqIDNo.13、SeqIDNo.14、SeqIDNo.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。


2.一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段。


3.根据权利要求2所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如SeqIDNo.13、SeqIDNo.14、SeqIDNo.15所示。


4.根据权利要求2或3所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV1或TMV3片段。


5.根据权利要求2或3所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿超，姜瀚林，刘茜，郭兆奎，田延平，刘锦，万秀清，刘文涛，李向东，李若，乔婵，
申请(专利权)人：中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所，山东农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23