肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，样本提取；第二步，利用LC‑MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；第三步，确定代谢物质；第四步，筛选显著性差异代谢物质。本发明专利技术首次建立了一种与肝硬化诊断相关阳离子标志物的筛选方法，筛选得到的酪胺阳离子、2‑苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子、Val‑Ile阳离子的组合以及2‑苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化诊断的新的标志物，为日后的肝硬化诊断药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。

Screening method and application of liver cirrhosis cation markers

【技术实现步骤摘要】
肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用
本专利技术涉及生化检测领域，尤其是涉及一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，即HCC），是一种高死亡率的原发性肝癌，它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球每年新发病例数约65万，其发病率占所有恶性肿瘤的第5位，死亡数约为60万，为所有恶性肿瘤的第3位。肝癌的发病原因多种多样，目前我国肝癌主要在乙肝肝硬化或非酒精性脂肪性肝炎所致肝硬化的基础上发展而来。即病毒性肝炎、肝硬化是肝细胞癌发生的主要病理基础。大多数的肝癌患者伴有肝硬化，从肝炎、肝硬化到肝癌，其形态改变往往是连续的。研究表明，肝细胞癌的发生大多是经历了一个从病毒性肝炎→肝硬化→肝癌的复杂过程。在肝硬化→肝癌的恶变进程中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程。肝癌癌前病变是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，持续时间较长。目前，肝硬化增生结节是一重要的癌前病变并已得到公认，因而，对肝硬化研究和认识的提高有助于早期肝癌的发现和治疗。但目前，对早期肝硬化的诊断主要依赖于超声和组织活检，超声技术的敏感性和特异性均不是很高，组织活检技术主要依赖于病理切片诊断，但其高费用、活检局限性（主要包括样本误差以及不同阅片者之间的偏倚等），促使人们开始寻找一种替代方法。近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。将疾病状态下异常的或者数量变大化极大的代谢小分子作为标志物，以用于诊断疾病的进程具有重要意义。液相色谱-质谱串联技术是代谢组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测、新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例。由于多种因素可影响机体的代谢状态，导致单一代谢物容易收到扰动，因此从众多代谢物中优选出由少数代谢物组成的“联合型代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P值（Probability），能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用，为日后肝硬化以及肝癌药物的研发提供了新的靶点和思路，对肝硬化的诊断和以及肝癌的预防具有重要意义。为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案：本专利技术提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25mM氨水和25mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95%流动相B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8min，65%～40%流动相B；8～9min，40%流动相B；9～9.1min，40%～95%流动相B；9.1～12min，95%流动相B;第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectraannotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计（OPLS-DA）对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质（变量权重值>1，且差异倍数>1.5或<0.75）后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质（P<0.05）即为肝硬化阳离子标志物。优选地，所述第二步中质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：所述第二步中质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：气体温度为250℃，干气体流速为16L/min，鞘气温度为400℃，鞘气流速为12L/min，Nozzle喷嘴电压为175V，喷雾器为20psig，Vcap升压电容正极为3000V，质量范围为50～1200道尔顿，数据采集速率为4HZ，每个循环的时间为50ms；质谱仪Ⅱ的ESI源设置参数为：离子源温度：650℃，离子源气体1：40，离子源气体2：80，离子源温度：650℃，气帘气：30，离子喷嘴电压：+5000V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，分布势能：±60V，正离子模式，碰撞能量：35±15eV，IDA的参数设置如下：排除同位素的质量范围：4道尔顿，每个周期监测的候选离子：10，按照质核比范围进行分段采集：50～300m/z，290～600m/z，590～900m/z，890～1200m/z。优选地，所述第一步中的提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液。优选地，所述第四步得到的显著性差异代谢物质包括酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子。优选地，本专利技术还提供了2-苯乙酰胺阳离子作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。优选地，本专利技术还提供了酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。单变量分析方法是最简单常用的实验数据分析方法。在进行两组样本间的差异代谢物分析时，常用的单变量分析方法包括变异倍数分析（FoldChangeAnalysis，FCAnalysis）、T检验，以及综合前两种分析方法的火山图（VolcanoPlot）。利用单变量分析可以直观地显示两样本间代谢物变化的显著性，从而帮助我们筛选潜在的标志代谢物。筛选出FC>1.5且Pvalue<0.05的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物。同时研究发现很多动植物及微生物的生理和病理变化通常伴随着代谢过程的异常改变，但是这些生理病理的变化通常只与部分代谢物的表达水平变化特异相关。因此，从海量的代谢组学数据中筛选标志代谢物并建立准确的判别模型，对于疾病的早期诊断和预后、以及生理过程的类型和时期的判别等具有重要意义。利用多变量统计分析方法建模，可以更好的筛选出差异代谢物。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是一种有监督的判别分析统计方法，是多变量统计分析方法之一，其采用偏最小二乘回归建立代谢产物的表达量与样品组别之间的关系模型，以达到对样品组别预测的目的。在OPLS-DA评分图上，有两种主成分（预测主成分和正交主成分），一般预测主成分只有1个，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：/n第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；/n第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；/n高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25 mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95%流动相 B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8 min，65%～40%流动相B；8～9 min，40%流动相B；9～9.1 min，40%～95%流动相B；9.1～12 min，95%流动相B；/n第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；/n第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物。/n...

【技术特征摘要】
1.一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；
第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；
高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25mM氨水和25mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5min，95%流动相B；0.5～7min，95%～65%流动相B；7～8min，65%～40%流动相B；8～9min，40%流动相B；9～9.1min，40%～95%流动相B；9.1～12min，95%流动相B；
第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectraannotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配<25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；
第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物。


2.根据权利要求1所述的肝硬化阳离子标志物的筛选方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：李捷，袁梓博，庞春，孙耀辉，李涛，杨翰，孙校炎，火钟坤，贺英杰，闫鑫，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41