检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。所述试剂盒包括6条环介导等温扩增引物：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，6条引物针对无乳链球菌NR‑113262.1基因的保守序列设计；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。本发明专利技术解决了现有的无乳链球菌检测技术周期长、成本高、不能应用于现场快速检测等问题。

Specific lamp primers, kits and methods for the detection of Streptococcus lactis

【技术实现步骤摘要】
检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测无乳链球菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，Sa)是一种传染性很强的革兰氏阳性细菌，可引起败血症、肺炎、新生儿脑膜炎及乳腺炎等多种疾病。目前，无乳链球菌的检测方法主要有传统分离培养、免疫学检测、分子生物学检测。传统分离培养具有操作繁琐，检验时间较长等缺点，不能满足快速检测的要求。免疫学检测简单快速，但灵敏度差，假阳性高，易产生交叉反应。分子生物学检测，特异性、灵敏度较高，但需要昂贵的仪器设备、对检测人员技术要求较高而使其不适用于现场快速检测及基层普及和推广应用。因此，建立一种简便、快速、特异、灵敏、经济可靠的无乳链球菌检测方法十分必要。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人提出的一种新颖的恒温核酸扩增技术，继该技术报道以来一直成为广大研究人员关注的焦点。经过不断改进和发展，该技术已经得到快速发展和广泛应用。其特点是针对靶基因的6个不同位点设计4条特异性引物，依赖于BstDNA聚合酶的高自循环链置换作用，在恒温条件下孵育一定时间，以高灵敏度，高特异性，高效性和快速性扩增靶核酸。通常在30～60分钟内可将目的基因扩增109～1010拷贝。
技术实现思路
本研究提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的环介导等温扩增方法检测无乳链球菌的试剂盒，并提供配套使用该试剂盒快速检测无乳链球菌的方法，从而为奶牛养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的目的是建立一种快速、特异、灵敏、检测方便的环介导恒温扩增方法检测无乳链球菌。本专利技术提供了一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，6条引物针对无乳链球菌NR-113262.1基因的保守序列设计，包括：外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。本专利技术提供了一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增试剂盒包括内引物10μMFIP/BIP、10μMF3/B3、10μMLB/LF各100μL。在上述环介导等温扩增(LAMP)试剂盒中，所述试剂盒还包括10×反应缓冲液1mL，8U/反应Bst聚合酶l00μL，1.2mMdNTP500μL，0.8M甜菜碱500μL以及1000×SYBRgreenI500μL。本专利技术提供了一种检测无乳链球菌的方法，包括：提取待检测样品基因组DNA；构建包括以下引物的反应体系：F3和B3、FIP和BIP以及LB和LF，其中，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；进行扩增反应；通过荧光染料的颜色变化来确定是否存在无乳链球菌。本专利技术具有以下优点：LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。本专利技术针对无乳链球菌的NR-113262.1基因保守序列设计筛选得到特异性LAMP引物，对无乳链球菌的目标基因进行检测，特异性与PCR相当，灵敏度高于PCR，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。在所检测菌株中均未出现非特异性扩增，说明该专利技术具有高特异性。本专利技术的另一些优点是(1)不需要特殊试剂与设备；(2)高特异性：针对六个区域设计六条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；(3)快速、高效扩增：从基因提取到检测只需1小时左右；(4)灵敏度高：检测灵敏度为4.9copies/μL，比常规PCR方法高10倍，(5)鉴定简便：通过裸眼观察鉴定，无需凝胶电泳等其他任何分析步骤。加入SYBRgreenI荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠。附图说明图1示出了无乳链球菌LAMP反应体系及反应条件优化电泳图。其中：A.Mg2+浓度的优化；M：DL2000DNAMark；1～9Mg2+浓度分别为：2、3、4、5、6、7、8、9mM；N阴性对照；B.dNTPs浓度的优化；1：DL2000DNAMark；1～8dNTPs浓度分别为：1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mM；N：阴性对照；C.甜菜碱浓度的优化；1：DL2000DNAMark；1～5甜菜碱浓度分别为：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0M；6：阴性对照；D.引物浓度比(外引物：内引物：环引物)的优化；M:DL2000DNAMark；1～7外引物：内引物：环引物为：1∶1∶1；1∶2∶2；1∶2∶4；1∶4∶2；1∶4∶4；1∶8∶2；1∶8∶4；N：阴性对照；E.反应温度的优化；M:DL2000DNAMark；1:57℃；2:59℃；3:61℃；4:63℃；5:65℃；6:67℃；N：阴性对照F.反应时间优化；M:DL2000DNAMark；1:20min；2:30min；3:40min；4:50min；5:60min；6:70min；N:阴性对照。图2示出了LAMP与PCR检测无乳链球菌灵敏度结果。图3示出了LAMP检测无乳链球菌琼脂糖凝胶电泳与可视化LAMP显色结果图。其中：1：无乳链球菌(亮绿色)；2：停乳链球菌；3：乳房链球菌；4：大肠杆菌；5：肺炎链球菌；6：表皮葡萄球菌；7:绿脓假单包菌；8：奇异变形杆菌；9：白色念珠球菌(ATCC10231)；10：白色念珠球菌(ATCC90028)11：伤寒沙门氏菌；12：金黄色葡萄球菌；N：阴性对照。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人提出的一种新颖的恒温核酸扩增技术，继该技术报道以来一直成为广大研究人员关注的焦点。本研究针对保守性和特异性良好的无乳链球菌NR-113262.1基因，利用LAMP技术原理，设计了LAMP引物组，进而对LAMP反应体系中的反应温度、反应时间、反应体系中Mg2+、甜菜碱、dNTPs、引物浓度进行了优化，成功建立了一种具有良好特异性和灵敏度的无乳链球菌LAMP可视化检测方法。通过对宁夏地区不同奶牛养殖场90份疑似感染无乳链球菌的患病奶样开展LAM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，其特征在于，6条引物针对无乳链球菌NR-113262.1基因的保守序列设计；包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，其特征在于，6条引物针对无乳链球菌NR-113262.1基因的保守序列设计；包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP及环引物LB和LF，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。


2.一种检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增试剂盒包括内引物10μMFIP/BIP、10μMF3/B3、10μMLB/LF各100μL。


3.所述的检测无乳链球菌的环介导等温扩增(LAM...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓玲，马臣杰，王雯雯，邓光存，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64