霜霉病菌培养和观察的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及霜霉病菌培养和观察的方法。霜霉病菌的采集；孢子囊悬浮液的制备；孢子囊悬浮液的培养。通过反复试验获得了一种能够诱导黄瓜霜霉病菌孢子囊萌发释放游动孢子、游动孢子通过运动和形态变化形成静止孢子，静止孢子萌发形成附着胞，附着胞萌发产生侵染丝的技术。该技术可为研究者进行霜霉病菌生物学基础、抗病性鉴定、杀菌剂筛选等的深入研究提供了有效的技术。通过该方法研究者可实现对霜霉菌游动孢子数量，形态变化以及形成侵染体数量的定量统计和监测，还可以实现杀菌剂作用机制的研究。清楚观察到霜霉病菌侵入寄主前必须经历的几个发育阶段。系统的观察方法将能够为该病菌的对症药物的防治提供第一手的资料。

Methods of culturing and observation of downy mildew

【技术实现步骤摘要】
霜霉病菌培养和观察的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及霜霉病菌培养和观察的方法。
技术介绍
黄瓜霜霉病是黄瓜生产中的重要病害,其传播流行速度很快,叶片上形成的病斑常导致叶片组织干枯，对黄瓜生产造成严重的影响。国内外对黄瓜霜霉病田间流行、与环境温湿度相关性，预警模型的建立等展开了大量研究。但是对黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis)生物学基础的研究相对薄弱，重要的原因是缺少相关的观察试验技术，制约了对霜霉病菌生物学基础的研究。黄瓜霜霉病菌作为卵菌，由于不能人工培养，在一定程度上限制了对病原菌生物学基础的研究，加之霜霉病菌无性繁殖孢子为游动孢子，游动孢子需要经历多个发育阶段才能成功侵入寄主，因此，游动孢子的形成、运动规律、休止、萌发等环节成为深入研究的必不可少的观察内容。由于缺少相关的观察方法，制约了该过程的观察，未能获得比较理想的试验结果，也未能得出能够反映霜霉病菌生长发育的最佳温度范围。截止目前未发现有相关文献的系统报道。大量的相关性分析结果依靠人工接种叶片促使其发病获得不同时间侵染至显症的温湿度范围。因此病菌需要经历多个阶段未能如期观察到。建立系统的观察方法，是当下急需解决的关键问题。通过查阅文献，有关霜霉病菌生物学基础的相关研究匮乏，重要的原因就是缺少观察技术的支撑。而现有的技术仍然是通过采集田间病叶获得病原菌的繁殖体，利用人工接种叶片，给与适宜的发病条件促进发病，进而获得病害发生需要的最佳的温湿度等，推断出适宜于霜霉病菌生长发育温度范围。不能对霜霉病菌孢子囊释放游动孢子、游动孢子数量的统计，游动、形成静止孢子以及萌发形成附着胞等侵入寄主前的5个关键发育环节未见有详细的报道。进而限制了对霜霉病菌侵入寄主前活动过程的观察，导致相关的研究进展缓慢。
技术实现思路
专利技术的目的：为了提供一种效果更好的霜霉病菌培养和观察的方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。为了达到如上目的，本专利技术采取如下技术方案：霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，包含如下步骤：霜霉病菌的采集：田间采集新鲜的霜霉病菌病斑，观察病斑背面长出的灰白色-灰黑色的霉层即霜霉病菌的孢囊梗和孢子囊；装入干净塑料袋中，带回实验室备用；孢子囊悬浮液的制备：将田间采回的霜霉病病叶，置于洁净的工作台上，肉眼仔细观察，以鲜黄色病斑叶背产生的霉层为菌种，用洁净的毛笔，轻轻顺势刷取叶背的霉层，顺势推送在装有灭菌或蒸馏水的离心管或指形瓶中，反复多次刷取，摇匀离心管或指形瓶，同时吸取含有孢子囊的悬浮液，滴于凹玻片上，盖上载玻片，置于显微镜下观察，观察孢子囊的个数和发育情况；孢子囊悬浮液的培养：将含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶置于有光照，温度为15℃-20℃度的培养箱中预培养1h。本专利技术进一步技术方案在于，在孢子囊悬浮液的培养后还包含如下步骤，孢子囊悬浮液置于低温预培养1h后，再将孢子囊悬浮液置于温度为23-26度的室温下培养1h。本专利技术进一步技术方案在于，取出置于常温下，采用凹玻片悬滴法制成玻片，置于显微镜下观察：首先低倍镜下观察找到需要观察的视野后，再在20倍或40倍物镜下观察。本专利技术进一步技术方案在于，包含如下步骤，实验前的准备工作：清洗离心管或指形瓶并进行灭菌处理，60度下烘干，灭菌水的制备：将蒸馏水装入三角瓶中进行灭菌锅灭菌处理；霜霉病叶的采集：采集时保留3-5cm的叶柄；采集标准：采集叶片正面具有鲜黄色的多角形病斑，叶背具有灰色至灰黑色或黑色的霜霉层即霜霉病菌的孢子囊梗或孢子囊，迅速装入保持袋中，防止叶片失水，影响孢子囊；或者是下午在太阳落山前采集，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水；带回实验室，叶柄用浸透蒸馏水的棉花包裹严实，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养，放入20度培养箱中保持培养12h；孢子囊悬浮液的制备：带上一次性手套，用洁净的毛笔，轻轻刷取孢子囊，避免手重刷到叶肉组织，制成孢子囊悬浮液待用；孢子囊悬浮液的预培养：调整培养箱，温度为15-20摄氏度均可，适度光照即可；将含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶放入培养箱中，培养1h后取出；变温处理：取出含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶后，置于试验平台上静置培养1h，温度为23-26摄氏度；显微镜观察：吸取孢子囊悬浮液滴在凹玻片上，放在显微镜下低倍镜下观察，可明显观察到活动剧烈的游动孢子、正在萌发释放游动孢子的孢子囊，游动孢子运动休止形成静止孢子，静止孢子萌发形成附着胞，附着胞进一步萌发形成侵染丝。该阶段可完成游动孢子数量的统计；计算游动孢子的释放率；以空囊率计算释放率，统计静止孢子，计算静止孢子的形成率和附着胞的萌发率；计算出侵染点或者侵染率；2h后，采用悬滴法观察：吸取孢子囊悬浮液，滴在凹玻片中，盖上盖玻片，置于显微镜下观察，可明显地观察到静止孢子、静止孢子萌发产生附着胞；3h后，采用悬滴法观察：吸取孢子囊悬浮液，滴在凹玻片中，盖上盖玻片，置于显微镜下观察，可明显地观察到静止孢子萌发产生的附着胞萌发产生侵染丝。本专利技术进一步技术方案在于，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养是采用如下专用设计装备完成的，该专用设计装备是保湿培养结构，该保湿培养结构包含相互扣合的培养皿下方1和培养皿上方2，培养皿下方1朝下热合着一个立方体形状的不锈钢滤网3，该不锈钢滤网3中放置有海绵4，培养皿上方2对应着海绵的位置包含一个顶盖孔5，该顶盖孔包含能够掀起来的顶盖8，打开顶盖后能够通过顶盖朝海绵倒入蒸馏水；由于海绵的最大持水能力一定，能够让海绵中的水朝下穿过不锈钢滤网3滴到保湿培养结构6上；因此不打开培养皿下方1和培养皿上方2避免空气中的杂菌进入就能加水；且海绵是断断续续持续滴水；所述的保湿培养结构6包含一个包覆结构，该包覆结构中部包含夹持空间7，夹持空间7为持水材料；霜霉病叶片能够放置进夹持空间7中使得霜霉病叶片两面都能接触到持水材料。本专利技术进一步技术方案在于，所述的持水材料为滤纸。采用如上技术方案的本专利技术，相对于现有技术有如下有益效果：通过反复试验获得了一种能够诱导黄瓜霜霉病菌孢子囊释放游动孢子、游动孢子通过运动和形态变化形成静止孢子，静止孢子萌发形成附着胞，附着胞萌发产生侵染丝的技术。该技术可为研究者进行霜霉病菌的深入研究提供了有效的技术。通过该方法可清楚观察到霜霉病菌侵入寄主前必须经历的几个发育阶段。系统的观察方法将能够为该病菌的对症药物的防治提供第一手的资料。附图说明为了进一步说明本专利技术，下面结合附图进一步进行说明：图1为诱导霜霉病菌游动孢子释放进而发育形成附着胞的流程图；图2为静止孢子、游动孢子、孢子囊、释放游动孢子、静止孢子萌发、附着胞、附着胞萌发形成的侵染丝的连续观察图示例；图3为本专利专门设计的保湿培养结构；图4为图3的俯视图；其中：1.培养皿下方；2.培养皿上方；3.不锈钢滤网；4.海绵持水空间；5.顶盖孔；6.保湿培养结构；7.夹持空间；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，包含如下步骤：/n霜霉病菌的采集：田间采集新鲜的霜霉病菌病斑，观察病斑背面长出的灰白色-灰黑色的霉层即霜霉病菌的孢囊梗和孢子囊；装入干净塑料袋中，带回实验室备用；/n孢子囊悬浮液的制备：将田间采回的霜霉病病叶，置于洁净的工作台上，肉眼仔细观察，以鲜黄色病斑叶背产生的霉层为菌种，用洁净的毛笔，轻轻顺势刷取叶背的霉层，顺势推送在装有灭菌或蒸馏水的离心管或指形瓶中，反复多次刷取，摇匀离心管或指形瓶，同时吸取含有孢子囊的悬浮液，滴于凹玻片上，盖上载玻片，置于显微镜下观察，观察孢子囊的个数和发育情况；/n孢子囊悬浮液的培养：将含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶置于有光照，温度为15℃-20℃度的培养箱中预培养1h。/n

【技术特征摘要】
1.霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，包含如下步骤：
霜霉病菌的采集：田间采集新鲜的霜霉病菌病斑，观察病斑背面长出的灰白色-灰黑色的霉层即霜霉病菌的孢囊梗和孢子囊；装入干净塑料袋中，带回实验室备用；
孢子囊悬浮液的制备：将田间采回的霜霉病病叶，置于洁净的工作台上，肉眼仔细观察，以鲜黄色病斑叶背产生的霉层为菌种，用洁净的毛笔，轻轻顺势刷取叶背的霉层，顺势推送在装有灭菌或蒸馏水的离心管或指形瓶中，反复多次刷取，摇匀离心管或指形瓶，同时吸取含有孢子囊的悬浮液，滴于凹玻片上，盖上载玻片，置于显微镜下观察，观察孢子囊的个数和发育情况；
孢子囊悬浮液的培养：将含有孢子囊悬浮液的离心管或指形瓶置于有光照，温度为15℃-20℃度的培养箱中预培养1h。


2.如权利要求1所述的霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，在孢子囊悬浮液的培养后还包含如下步骤，孢子囊悬浮液置于低温预培养1h后，再将孢子囊悬浮液置于温度为23-26度的室温下培养1h。


3.如权利要求2所述的霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，取出置于常温下，采用凹玻片悬滴法制成玻片，置于显微镜下观察：首先低倍镜下观察找到需要观察的视野后，再在20倍或40倍物镜下观察。


4.如权利要求2所述的霜霉病菌培养和观察的方法，其特征在于，包含如下步骤，
实验前的准备工作：清洗离心管或指形瓶并进行灭菌处理，60度下烘干，
灭菌水的制备：将蒸馏水装入三角瓶中进行灭菌锅灭菌处理；
霜霉病叶的采集：采集时保留3-5cm的叶柄；采集标准：采集叶片正面具有鲜黄色的多角形病斑，叶背具有灰色至灰黑色或黑色的霜霉层即霜霉病菌的孢子囊梗或孢子囊，迅速装入保持袋中，防止叶片失水，影响孢子囊；或者是下午在太阳落山前采集，迅速装入保湿袋中，防止叶片失水；带回实验室，叶柄用浸透蒸馏水的棉花包裹严实，放入15cm底部铺有饱和水分的滤纸的培养皿中进行保湿培养，放入20度培养箱中保持培养12h；
孢子囊悬浮液的制备：带上一次性手套，用洁净的毛笔，轻轻刷取孢子囊，避免手重刷到叶肉组织，制成孢子囊悬浮液待用；
孢子囊悬浮液的预培养：...

【专利技术属性】
技术研发人员：史娟，田芸瑞，马新，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64