用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法，其包括以下步骤：a.将样品施加在基底上，b.添加适合于标记的探针，所述探针通过与生物治疗物质的聚集体的特异性结合来标记它们，和c.检测经标记的生物治疗物质的聚集体，其中步骤b)可以在步骤a)之前实施。公开了一种用于实施该方法的试剂盒。

A method for the detection of aggregates of biological therapeutic substances in samples

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法本专利技术涉及用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法。
技术介绍
生物制药产品分为生物制剂及其仿制-制剂生物仿制药，是在活体中制备的治疗剂的那些类别。这些产品此外包括重组蛋白质和抗体。这些产品在各种疾病如糖尿病、各种癌症和炎性疾病的治疗中起关键作用。生物制药产品从医学角度来看是最具吸引力的治疗剂，因为蛋白质和抗体就其效果而言具有出色的活性和特异性。然而，由于这些高分子量物质相对于传统的低分子量药物的结构复杂性造成的，最大的挑战在于物理和化学稳定性方面。这些蛋白质的错误折叠和随后聚集，可以在这种治疗剂的产品周期的每个单独的阶段期间发生。这些阶段包括产品的表达、折叠、纯化、灭菌、运输、储存和交付。蛋白质聚集的后果是一方面活性降低，并且特别不利的是产品的免疫原性增加。当免疫系统将活性物质识别为抗原并形成针对该活性物质的抗体时，这导致其降解或者甚至导致变应性反应。这使得治疗无效甚至可能危险。将任何自缔合的蛋白物种定义为均质蛋白聚集体，其中单体为最小天然存在的单位或亚单位。将聚集体按五个特征来划分：尺寸、可逆性(解离)、构象、化学修饰和形态[1]。最小的聚集体单位对应于两个单体(二聚体)，其中单体的数目此外向上不设置限制[1]。不利地，即使对于生物制药的蛋白质产品的最小聚集体单位，也已经发现了免疫应答[2]。除了均质蛋白质聚集体之外，也存在异质聚集体，其中蛋白质单体可以与一种或多种其它蛋白质物种或者有机或无机杂质缔合。可以由聚集体引起或增强免疫应答的受影响的机理是不同的。这些包括a)B细胞受体的增加的交联，这可引起它们的活化[3]，b)增加的抗原摄取、加工和呈递，以及随后的免疫刺激信号的触发[4]。这种机制可以激发T细胞以产生抗体。由聚集体引起的免疫应答的最大临床风险取决于聚集体中单体表位的维持或变性。在维持表位的情况下，最初仅针对聚集体的抗体也可以结合单体并降低或中和它们的效果。在变性的情况下，抗体仅针对聚集体，而天然蛋白质的活性物质活性不受不利影响。在这两种情况下，免疫应答可能直至导致过敏反应，这对于患者来说可能是危险的。目前（Gegenwertig）还没有用于分析生物制药制剂中的杂质、聚集体部分及其尺寸的标准化方法。将聚集体按尺寸划分成两类并且建议了合适的测量方法。聚集体＞1μm：为了确定大的聚集体和杂质，典型地使用光学方法，例如光衰减(LO)、动态成像颗粒分析(DIPA)和微流成像(MFI)以及库伦计数器(CC)的电化学方法。对于这些方法的成熟形式，也可以确定存在的聚集体的数目、尺寸和形状。在0.1μm-1μm之间的聚集体：在该尺寸范围内使用用于检测小的聚集体的复杂体系。这些包括尺寸排阻色谱(SEC)、分析超速离心(AUC)和非对称场流分级(AF4)。为了提高这些仪器的灵敏度，经常将它们与质谱仪耦合。虽然这些技术允许聚集体的定量和分布。不利的是确定组成，并且这些方法仅有限制地适合于高通量应用。需要关于聚集体-类型和聚集体数量的信息，以确定从哪个聚集体部分开始对治疗蛋白质发生免疫应答。迄今为止，免疫应答主要归因于大的聚集体和颗粒[3]，即使可以想到，所形成的聚集体和产品的量可能因产品而改变并且可能导致不同的临床情况。尽管0.1-10μm范围内的颗粒和聚集体也能够潜在地起免疫原作用的这一认识缓慢地获得承认，但是现在所使用的方法缺少确定其的精度[5]。专利技术目的本专利技术的目的是提供用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的高灵敏度方法。本专利技术的另一个目的是提供用于实施该方法的试剂盒。对此的其它目的和解决方案由本专利技术的说明书以及从属权利要求中获悉。所述目的的解决方案所述目的用根据专利权利要求1的方法和根据副权利要求的试剂盒得以实现。对此的有利的实施方案各自由与其相关（hieraufrückbezogenen）的专利权利要求获悉。
技术实现思路
所述目的通过用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法得以实现，该方法包括以下步骤：a.将样品施加在基底上，b.添加适合于检测的探针，所述探针通过特异性结合至生物治疗物质的聚集体上来标记它们，和c.检测经标记的生物治疗物质的聚集体，其中步骤b)可以在步骤a)之前实施。因此，也可以首先将探针，然后将样品添加至基底。所述用于检测和尤其是用于定量和/或定性测定均质和异质聚集体的方法的特征在于，生物制药产品的聚集体和生物制药产品中的聚集体包含至少一个用于探针的结合位点。任选地，该聚集体也包含至少一个用于捕获剂分子的结合位点。该方法因此包括以下步骤：a)将捕获剂分子固定在基底上，b)使具有生物制药产品的样品在溶液中与捕获剂分子接触，c)通过结合至捕获剂分子，将存在于生物制药产品的溶液中的一种或多种分子的单体和/或聚集体固定在基底上，d)使探针与所述单体和/或聚集体接触，e)将探针结合至所述单体和/或聚集体上，其中，所述探针能够产生给定的信号，并且步骤b)和d)能够同时进行，或者步骤d)能够在步骤b)之前进行。如果步骤b)和d)同时进行，则因此步骤c)和e)也同时实施。在另一变体中，其中步骤d)在步骤b)之前实施，因此在步骤c)中将用探针标记的单体和聚集体固定到基底上。因此也就是步骤e)在步骤b)和c)之前进行。在本专利技术的意义上，"定量测定"首先意味着测定聚集体的浓度，因此也就意味着确定其存在和/或不存在。优选地，定量测定也意味着选择性地定量聚集体组成。这种定量可以通过相应的探针进行。在本专利技术的意义上，"定性测定"意味着表征聚集体组成。用一个或多个可用于检测的探针标记聚集体。所述探针包含识别并且结合至聚集体或其单体的结合位点的亲和分子。此外，所述探针包含至少一种检测分子或分子部分，其结合至亲和分子或分子部分上，并且可借助于化学或物理方法检测和/或测量。在一个替代方案中，探针可以具有相同的亲和分子或分子部分与不同的检测分子(或部分)。在另一替代方案中，不同的亲和分子或分子部分可以与不同的检测分子或部分组合，或者替代地，不同的亲和分子或部分可以与相同的检测分子或部分组合。也可以使用不同的探针的混合物。与不同的检测分子或分子部分偶联的多个不同的探针的使用，一方面增加了信号(相关信号)的特异性，另一方面使得在其组成方面不同的聚集体的识别成为可能。这使得聚集体的选择性定量和表征成为可能。在一个实施方案中，位置分辨地（ortsaufgelöst）确定探针信号，即位置分辨地检测由探针发射的信号。因此，在本专利技术的这个实施方案中，排除了基于非位置分辨信号的方法，如ELISA或三明治-ELISA。在检测时，高的位置分辨率是有利的但并非必需的。在根据本专利技术的方法的一个实施方案中，在这种情况下收集如此多的数据点，以允许先于背景信号检测聚集体，所述背景信号例如由仪器特异性噪声、其它非特异性信号或非特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法，其包括以下步骤：/na. 将样品施加在基底上，/nb. 添加适合于检测的探针，所述探针通过特异性结合至生物治疗物质的聚集体上来标记它们，和/nc. 检测经标记的生物治疗物质的聚集体，其中步骤b)可以在步骤a)之前实施。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170613 DE 102017005544.0;20171113 DE 102017010451.用于检测样品中的生物治疗物质的聚集体的方法，其包括以下步骤：
a.将样品施加在基底上，
b.添加适合于检测的探针，所述探针通过特异性结合至生物治疗物质的聚集体上来标记它们，和
c.检测经标记的生物治疗物质的聚集体，其中步骤b)可以在步骤a)之前实施。


2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，
在步骤a)之前，将用于聚集体的捕获剂分子固定在基底上。


3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
进行样品的预处理。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
使用由玻璃制成的基底。


5.根据前述权利要求1至3中任一项所述的方法
其特征在于，
使用由塑料制成的基底。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述基底具有亲水性涂层。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述基底涂覆有糊精。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述基底涂覆有聚乙二醇。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述糊精-涂层具有用于偶联生物分子的官能团。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述聚乙二醇-涂层具有用于偶联生物分子的官能团。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述基底涂覆有用于偶联生物分子的官能团。


12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
亲水性涂层涂覆有用于偶联生物分子的官能团。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述捕获剂分子是结合至所述基底上或所述涂层上的。


14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述捕获剂分子是抗体或抗体的片段。


15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述捕获剂分子是适体。


16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述捕获剂分子特异性结合生物治疗物质的单体的一个或多个表位。


17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述捕获剂分子特异性结合生物治疗物质的聚集体。


18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述探针分子特异性结合生物治疗物质的单体的一个或多个表位。


19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
其特征在于，
所述探针分子特异性结合生物治疗物质的聚集体。


20.根据前述权利要求中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：C扎菲乌，A库拉维克，O班纳赫，D维尔博尔德，
申请(专利权)人：于利奇研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE