稳定的嵌合FAB制造技术

本文提供了源自具有λ轻链的亲本嵌合Fab的稳定的嵌合Fab。所述稳定的嵌合Fab包含来自所述亲本嵌合Fab的免疫球蛋白重链多肽构建体，其具有CH1序列和VH序列；以及Vλ‑Cκ嵌合轻链构建体。所述嵌合轻链构建体的所述Vλ序列对应于所述亲本嵌合Fab的所述Vλ序列，并且包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，与所述亲本嵌合Fab相比，所述氨基酸修饰增加所述稳定的嵌合Fab的热稳定性。所述稳定的Fab可用作治疗性多肽，或可用于制备其他形式的抗体构建体。所述稳定的嵌合Fab通常还可用于增加具有λ轻链的抗体的稳定性。

Stable chimeric Fab

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的嵌合FAB对在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用本申请包含已经通过EFS-Web提交的序列表，并且将所述序列表据此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2018年6月27日，名称为2018-06-27(097993-1092280(001610WO))SequenceListing.txt，并且大小为45个字节。
技术介绍
抗体可用于许多应用中，包括作为研究工具，作为诊断剂，当然也可作为治疗剂，所有这些应用都需要抗体的大量制造。抗体的物理特性(诸如热稳定性)可影响抗体的可制造性。例如，热稳定性低的抗体或发生聚集的抗体难以制造和储存。天然存在的抗体和已经人工生成的抗体(例如通过噬菌体展示或重组工程化)表现出广泛的热稳定性，其中人工生成的抗体通常具有使其制造困难的热稳定性水平(McConnell等人(2014)mAbs：6：1274-1282)。此外，已有人提出，在从合成Fab文库中鉴定的抗体中，包含来自λ轻链的可变结构域的抗体的平均解链温度低于包含来自κ轻链的可变结构域的抗体的平均解链温度(Tiller等人(2013)Mabs5：3，445-470)。可以构建包含嵌合轻链的嵌合Fab以用于多种目的。例如，在将噬菌体展示生成的scFv转化为Fab形式以获得天然存在形式的抗体时可以生成嵌合Fab。另外，可以构建小鼠-人嵌合抗体，以用于降低小鼠抗体在人中的免疫原性。嵌合Fab可包含可变λ结构域和恒定κ结构域(Vλ-Cκ)，或可变κ结构域和恒定λ结构域(Vκ-Cλ)。相对于包含亲本λ轻链的Fab，具有嵌合轻链的嵌合Fab通常表现出热稳定性的降低。因此，需要增加嵌合Fab以及具有λ轻链的抗体的热稳定性，以便改善它们的可制造性。
技术实现思路
本公开提供了稳定的嵌合Fab。在一个方面，提供了一种稳定的嵌合Fab或嵌合异二聚体，其包含：第一免疫球蛋白重链多肽构建体(H1)，其包含重链恒定结构域1(CH1)序列和重链可变结构域(VH)序列；以及第一嵌合免疫球蛋白轻链多肽构建体(L1)，其包含κ轻链恒定结构域(Cκ)序列和λ轻链可变结构域(Vλ)序列，Vλ序列包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，与不具有稳定的氨基酸取代的对应野生型嵌合异二聚体相比，所述氨基酸修饰增加嵌合异二聚体的热稳定性，其中H1和L1形成与第一表位结合的第一Fab区。在另一方面，提供了一种抗体构建体，其包含：第一异二聚体，其中第一异二聚体是本文所述的稳定的嵌合Fab或嵌合异二聚体；以及支架，其中所述第一异二聚体的H1和L1中的至少一个利用或不利用接头与支架连接。在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含稳定的嵌合Fab或嵌合异二聚体，或本文所述的抗体构建体，以及药学上可接受的载体。在另一方面，提供了一种多核苷酸或多核苷酸组，其编码稳定的嵌合Fab或嵌合异二聚体，或本文所述的抗体构建体。在另一方面，提供了一种载体或载体组，其包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。在另一方面，提供了一种分离细胞，其包含本文所述的多核苷酸、多核苷酸组、载体或载体组。在另一方面，提供了一种制备稳定的嵌合Fab或嵌合异二聚体或本文所述的抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含编码嵌合异二聚体或抗体构建体的多核苷酸或多核苷酸组的宿主细胞；在允许嵌合异二聚体或抗体构建体表达的条件下，在宿主细胞培养物中培养宿主细胞；以及从宿主细胞培养物中收集嵌合异二聚体或抗体构建体。在另一方面，提供了一种嵌合轻链多肽构建体，其包含κ轻链恒定结构域(Cκ)序列和λ轻链可变结构域(Vλ)序列，Vλ序列包含一个或多个稳定的氨基酸取代，所述稳定的氨基酸取代增加包含嵌合轻链的嵌合异二聚体的热稳定性。在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的嵌合轻链多肽构建体，以及药学上可接受的载体。在另一方面，提供了一种多核苷酸，其编码本文所述的嵌合轻链多肽构建体。在另一方面，提供了一种增加包含λ免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的抗体的热稳定性的方法，所述方法包括：制备包含抗体的Vλ序列以及来自具有κ轻链的抗体的Cκ序列的Vλ-Cκ嵌合轻链，其中Vλ序列包含一个或多个稳定的氨基酸修饰；以及表达Vλ-Cκ嵌合轻链与免疫球蛋白重链，以获得热稳定性增加的抗体。在另一方面，提供了一种治疗受试者的癌症、自身免疫疾病、炎性病症或传染性疾病的方法，所述方法包括向受试者或患者施用有效量的本文所述的嵌合异二聚体或抗体构建体。在另一方面，提供了有效量的本文所述的嵌合异二聚体或抗体构建体在治疗受试者的癌症、自身免疫疾病、炎性病症或传染性疾病中的用途。在一个实施方案中，提供了本文所述的嵌合异二聚体或抗体构建体在制备用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎性病症或传染性疾病的药物中的用途。在另一个实施方案中，提供了用于治疗受试者的癌症、自身免疫疾病、炎性病症或传染性疾病的本文所述的嵌合异二聚体或抗体构建体。附图说明图1描绘了Vλ-Cκ嵌合Fab以及用于改善Vλ-Cκ嵌合Fab的热稳定性的工程化方法的示意图。示出了WT(野生型)λFab(也称为亲本λFab)，其具有野生型重链Fab序列(VH和CH1结构域，灰色填充)和野生型λ轻链(白色填充)。通过将亲本λ轻链的Cλ序列与Cκ序列交换以形成Vλ-Cκ嵌合轻链构建体，可以将该亲本λFab工程化为亲本嵌合Fab(Vλ-Cκ嵌合Fab)。因此，Vλ-Cκ嵌合轻链构建体包含来自亲本λFab的Vλ序列(白色填充)，其与Cκ序列(散列填充)融合。通过在Vλ序列中引入突变以模拟在可变κ结构域与恒定κ结构域之间观察到的界面(Vκ-Cκ)，改善Vλ-Cκ界面的相容性，可以增加亲本嵌合Fab的热稳定性。此稳定的嵌合Fab在图1中被描绘为“经设计的Vλ-Cκ嵌合Fab”，其中星号表示稳定的氨基酸修饰(也称为稳定性优化设计)。亲本嵌合Fab在本文中也称为“野生型嵌合异二聚体”。图2示出用于抗体CAT-2200的示例性Vλ-Cκ嵌合轻链构建体的序列。将对应于CAT-2200的WTλ轻链序列(来自PDB条目2VXS，链L)与基于CAT-2200抗体的Vλ-Cκ嵌合轻链构建体进行比对，以突出显示这两个构建体之间的差异。Vλ-Cκ嵌合轻链构建体由终止于残基L106A处的CAT-2200的λ可变结构域序列和起始于位置R108处的与IGKC*01相对应的κ恒定结构域序列组成。星号(*)指示具有单个保守残基的位置；冒号(：)指示强相似特性的组之间的保守性；句点(.)指示弱相似特性的组之间的保守性；并且如EMBL-EBI网站上所引用，无共有符号指示有很大不同的残基。图3A-3D描绘了轻链中的可变结构域-恒定结构域界面的带状图。图3A描绘了Fab的示意图。在图3B至图3D中放大了与加框区域相对应的区域。图3B突出显示了Vκ-Cκ界面处的热点残基83、85和105(D3H44抗体，PDB：1jpt)。图3C描绘了Vλ-Cλ界面(CAT-2200抗体，PDB：2vxs)，也突出显示了残基83、8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合异二聚体，其包含：/na) 第一免疫球蛋白重链多肽构建体(H1)，其包含重链恒定结构域1 (CH1)序列和重链可变结构域(VH)序列，以及/nb) 第一嵌合免疫球蛋白轻链多肽构建体(L1)，其包含κ轻链恒定结构域(Cκ)序列和λ轻链可变结构域(Vλ)序列，所述Vλ序列包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，与不具有所述稳定的氨基酸修饰的对应野生型嵌合异二聚体相比，所述稳定的氨基酸修饰增加所述嵌合异二聚体的热稳定性，/n其中H1和L1形成与第一表位结合的第一Fab区。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/5275611.一种嵌合异二聚体，其包含：
a)第一免疫球蛋白重链多肽构建体(H1)，其包含重链恒定结构域1(CH1)序列和重链可变结构域(VH)序列，以及
b)第一嵌合免疫球蛋白轻链多肽构建体(L1)，其包含κ轻链恒定结构域(Cκ)序列和λ轻链可变结构域(Vλ)序列，所述Vλ序列包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，与不具有所述稳定的氨基酸修饰的对应野生型嵌合异二聚体相比，所述稳定的氨基酸修饰增加所述嵌合异二聚体的热稳定性，
其中H1和L1形成与第一表位结合的第一Fab区。


2.根据权利要求1所述的嵌合异二聚体，其中所述Vλ序列在所述Cκ序列与所述Vλ序列之间的界面处的一个或多个氨基酸处包含一个或多个稳定的氨基酸修饰。


3.根据权利要求2所述的嵌合异二聚体，其中所述Vλ序列在选自残基80、83、105和106中的一个或多个的位置处包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，其中所述氨基酸残基的编号是根据Kabat。


4.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基83被疏水性氨基酸取代。


5.根据权利要求4所述的嵌合异二聚体，其中所述疏水性氨基酸为F、L、I、V或A。


6.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基83被极性不带电荷的氨基酸取代。


7.根据权利要求6所述的嵌合异二聚体，其中所述极性不带电荷的氨基酸是S、T、H、N或Q。


8.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基83被A、F、I、V、L、T、S、N、H或Q取代。


9.根据权利要求8所述的嵌合异二聚体，其中残基83被A取代。


10.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基105被带负电荷的氨基酸取代。


11.根据权利要求10所述的嵌合异二聚体，其中所述带负电荷的氨基酸为D或E。


12.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基105被极性不带电荷的氨基酸取代。


13.根据权利要求12所述的嵌合异二聚体，其中所述极性不带电荷的氨基酸为N或Q。


14.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基105被E、D、N或Q取代，并且残基106被I、L或M取代。


15.根据权利要求1所述的嵌合异二聚体，其中所述Vλ序列在残基85处包含一个或多个稳定的氨基酸修饰，其中所述残基的编号是根据Kabat。


16.根据权利要求15所述的嵌合异二聚体，其中残基85被极性不带电荷的氨基酸取代。


17.根据权利要求16所述的嵌合异二聚体，其中所述极性不带电荷的氨基酸是S、H或Q。


18.根据权利要求15所述的嵌合异二聚体，其中残基85被疏水性氨基酸取代。


19.根据权利要求18所述的嵌合异二聚体，其中所述疏水性氨基酸为V或A。


20.根据权利要求15所述的嵌合异二聚体，其中残基85被TV、N、A、Y、S、H或Q取代。


21.根据权利要求1至20中任一项所述的嵌合异二聚体，其中所述Vλ序列在选自残基83、85、105和106的位置处包含稳定的氨基酸修饰的组合。


22.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基80被极性不带电荷的氨基酸取代。


23.根据权利要求22所述的嵌合异二聚体，其中所述极性不带电荷的氨基酸是S、N或Q。


24.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基80被疏水性氨基酸取代。


25.根据权利要求24所述的嵌合异二聚体，其中所述疏水性氨基酸为A、P或V。


26.根据权利要求3所述的嵌合异二聚体，其中残基80被A、P、V、S、N或Q取代。


27.根据权利要求21至26中任一项所述的嵌合异二聚体，其中所述Vλ序列在以下残基处包含稳定的氨基酸修饰：残基83和85处；残基83和106处；残基105和106处；残基105和106A处；残基83和105处；残基85和105处；残基85和106处；残基83、85和105处；残基83、105和106A处；残基83、85和106处；残基83、105和106处；残基85、105和106处；残基80、83、85和105处；残基80、83、85和105处；残基80、85、105和106处；残基80、83、105和106处；残基80、83、85、105、106处；残基83、85、105和106处；残基80、83、105和106A处；残基83、105、106和106A处；残基80、83、85、105和106A处；残基80、83、105、106和106A处；残基83、85、105、106和106A处；或残基80、83、85、105、106和106A处。


28.根据权利要求27所述的嵌合异二聚体，其中所述稳定的氨基酸取代为83F和85T；83V和85T；83I和85T；83A和85T；83F和105E；83V和105E；83I和105E；83A和105E；83F和106I；83V和106I；83I和106I；83A和106I；83F、85T或85V、105E和106I；83V、85T或85V、105E和106I；83I、85T或85V、105E和106I；83A、85T或85V、105E和106I；83F、105E和106AK；83F、105E、106I和106AK；80A、83F、105E和106AK；80A、83F、105E、106I和106AK；80A、83F、85T、105E和106AK；80A、83F、85T、105E、106I和106AK；或80P、83F、85T、105E、106I和106AK。


29.根据权利要求1至28中任一项所述的嵌合异二聚体，其中H1和L1是人或人源化序列。


30.根据权利要求1至29中任一项所述的嵌合异二聚体，其中所述嵌合异二聚体与药物缀合。


31.一种抗体构建体，其包含：
a)第一异二聚体...

【专利技术属性】
技术研发人员：D尤罗塞夫，周杨捷，
申请(专利权)人：酵活有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA