一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术及应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术及其在基因检测中的应用，本发明专利技术提供的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，通过在多交叉置换扩增中的扩增引物C1的5’端标记标记物，所述方法针对鲍曼不动杆菌特异基因pgaD(标记异硫氰酸荧光素FITC)及其碳青霉烯耐药基因blaOXA‑23‑like(标记异羟基洋地黄毒苷Dig)的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广应用于各种特异核苷酸片段的检测，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的检测。

A detection technology combining multiple cross displacement amplification and gold nanoparticle detection and its application

【技术实现步骤摘要】
一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术及应用。
技术介绍
核酸检测，即核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，核酸扩增技术包括PCR扩增技术、恒温扩增技术等，恒温扩增技术相较PCR及其衍生技术而言，具有不依赖于热循环扩增设备，整个扩增过程恒定在固定的温度，反应速度快，敏感性强，特异性高等特点，有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。目前，应用较为广泛的恒温扩增技术有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)及交叉扩增(CPA)等，检测时存在不够便捷、快速、敏感、特异的问题。
技术实现思路
鉴于上述问题，提出了本专利技术以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术及其在基因检测中的应用。本专利技术实施例中提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，包括：自所述目标基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目标基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有与序列C1互补的序列C1s和序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有与序列F2s互补的序列，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2互补的序列C2s和序列P2；提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，在所述扩增引物C1的5’端标记标记物，获得扩增引物C1*；在BstDNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得标记MCDA目标基因片段；所述引物包括：置换引物F1和F2，交叉引物CP1和CP2，扩增引物D1、C1*、R1、D2、C2、R2；以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对所述检测物进行检测。进一步的，所述标记物包括如下之一：异硫氰酸荧光素FITC、异羟基洋地黄毒苷Dig。进一步的，所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度范围为61-65℃。进一步的，所述温度为63℃。进一步的，进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。进一步的，所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、抗异羟基洋地黄毒苷抗体anti-Dig、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。基于同一专利技术构思，本专利技术实施例还提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术的应用，用于检测鲍曼不动杆菌特异基因pgaD和鲍曼不动杆菌的碳青霉烯耐药基因blaOXA-23-like。进一步的，用于检测所述pgaD时，标记物为所述FITC，金标垫中物质包括如下之一：所述SA-G、所述B-BSA、所述anti-FITC；用于检测所述blaOXA-23-like时，标记物为所述Dig，金标垫中物质包括如下之一：所述SA-G、所述B-BSA、所述anti-Dig。进一步的，用于检测所述pgaD时，引物选自下列序列组合：如SEQIDNO：1所示的置换引物F1，如SEQIDNO：2所示的交叉引物CP1，如SEQIDNO：3所示的扩增引物C1*，如SEQIDNO：4所示的扩增引物D1，如SEQIDNO：5所示的扩增引物R1，如SEQIDNO：6所示的扩增引物R2，如SEQIDNO：7所示的扩增引物D2，如SEQIDNO：8所示的扩增引物C2，如SEQIDNO：9所示的交叉引物CP2，如SEQIDNO：10所示的置换引物F2；用于检测所述blaOXA-23-like时，引物选自下列序列组合：如SEQIDNO：11所示的置换引物F1，如SEQIDNO：12所示的交叉引物CP1，如SEQIDNO：13所示的扩增引物C1*，如SEQIDNO：14所示的扩增引物D1，如SEQIDNO：15所示的扩增引物R1，如SEQIDNO：16所示的扩增引物R2，如SEQIDNO：17所示的扩增引物D2，如SEQIDNO：18所示的扩增引物C2，如SEQIDNO：19所示的交叉引物CP2，如SEQIDNO：20所示的置换引物F2。本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本专利技术实施例提供的检测方法，通过在多交叉置换扩增中的扩增引物C1的5’端标记标记物，所述方法针对鲍曼不动杆菌特异基因pgaD(标记异硫氰酸荧光素FITC)及其碳青霉烯耐药基因blaOXA-23-like(标记异羟基洋地黄毒苷Dig)的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广应用于各种特异核苷酸片段的检测，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的检测。MCDA的检测原理基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。LFB检测原理基于抗体(包被在LFB上)和半抗原(在引物的5’端标记)的结合。当有阳性扩增产物时，半抗原标记的扩增序列将与包被在检测线区域的抗体结合，呈现红色，从而对扩增产物进行可视化检测。与其他扩增产物的检测方法相比，LFB相对简单、快速和客观，可在几分钟内中显示扩增结果。综上，MCDA扩增技术对原始信号有指数级的放大作用，LFB检测技术简单快速客观。将MCDA扩增技术和LFB检测技术结合则可对原始核酸序列起到指数级的放大作用，极大提高检测精度，缩短检测时间，实现对目的分子的精准检测。MCDA-LFB较既往检测方法能更加快速精准鉴定鲍曼不动杆菌及其碳青霉烯耐药性。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。而且在整个附图中，用相同的参考图形表示相同的部件。在附图中：图1是本专利技术实施例中MCDA引物设计的位置和方向示意图，其中，A表示pgaD，B表示blaOXA-23-like；图2是本专利技术实施例中MCDA扩增原理示意图；图3是本专利技术实施例中金纳米生物传感器检测示意图；图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，包括：/n自所述目标基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目标基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；/n提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有与序列C1互补的序列C1s和序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有与序列F2s互补的序列，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2互补的序列C2s和序列P2；/n提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，在所述扩增引物C1的5’端标记标记物，获得扩增引物C1*；/n在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得标记MCDA目标基因片段；所述引物包括：置换引物F1和F2，交叉引物CP1和CP2，扩增引物D1、C1*、R1、D2、C2、R2；/n以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对所述检测物进行检测。/n...

【技术特征摘要】
1.一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，包括：
自所述目标基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目标基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；
提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有与序列C1互补的序列C1s和序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有与序列F2s互补的序列，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2互补的序列C2s和序列P2；
提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，在所述扩增引物C1的5’端标记标记物，获得扩增引物C1*；
在BstDNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得标记MCDA目标基因片段；所述引物包括：置换引物F1和F2，交叉引物CP1和CP2，扩增引物D1、C1*、R1、D2、C2、R2；
以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对所述检测物进行检测。


2.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征在于，所述标记物包括如下之一：异硫氰酸荧光素FITC、异羟基洋地黄毒苷Dig。


3.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征在于，所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度范围为61-65℃。


4.根据权利要求3所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征在于，所述温度为63℃。


5.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征在于，进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。


6.根据权利要求5所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征在于，所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。


7.根据权利要求5所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测的检测技术，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡守奎，闫琳琳，赵帆，牛莉娜，蔡煜，吴蕾，朱晓雪，高乃姝，农金轻，邢喆，
申请(专利权)人：北京大学首钢医院，
类型：发明
国别省市：北京;11