一种拟蕈状芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术一种拟蕈状芽孢杆菌，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术的提供一种拟蕈状芽孢杆菌且提供其基因序列，另外利用了该种一种拟蕈状芽孢杆菌来降解羽毛，降解效率高且降解前不需要对羽毛进行前处理，降解的过程不会对环境造成污染。

A fungus like Bacillus

【技术实现步骤摘要】
一种拟蕈状芽孢杆菌
本专利技术涉及生物学及基因工程
，特别是涉及一种拟蕈状芽孢杆菌。
技术介绍
近年来，我国家禽养殖产业迅猛发展，羽毛可占肉鸡体重的5％-7％，每年产量超过100万吨，大部分却并未得到利用，通常会被填埋或焚烧，不仅造成资源的巨大浪费，而且严重污染环境，甚至传播疾病，引起鸡新城疫、气囊炎和角膜结膜炎等，除此之外，焚烧还会释放出有害气体，而排放的氨、恶臭硫化氢导致头痛、恶心、腹泻等健康问题。羽毛中富含角蛋白，粗蛋白的含量可达85％以上，且氨基酸组成比较齐全，其中半胱氨酸的含量更是所有天然饲料之最。但角蛋白是一类富含二硫键结构稳定的“不溶于水的硬性蛋白”。目前，通常采用高温高压、强酸强碱和挤压膨化等物理化学方法对羽毛进行处理，工艺复杂、耗能多，且易引起环境污染。目前分离得到的多数羽毛降解菌降解羽毛效果不理想，且大部分微生物降解羽毛尚需要一定的前处理，筛选能够高效降解天然羽毛的微生物菌株更具有应用性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种拟蕈状芽孢杆菌，用来高效降解羽毛的菌株，提高羽毛降解效率。首先，本专利技术公开一种拟蕈状芽孢杆菌，其核苷酸序列为如SEQIDNO.1所示，该菌种还能用来降解羽毛。本专利技术的技术方案为：1材料和方法1.1实验材料北海养海鸭场内废弃羽毛堆积处采土样。家禽市场收集的鸡羽毛，用水洗净，烘干至衡重。1.2培养基LB营养培养基(g/L)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂20g，pH7.2～7.5富集培养基(g/L)：酵母粉1g，NaCl0.5g，K2HPO41g，MgSO40.1g，未剪碎的羽毛少量，pH7.0初筛培养基(g/L)：酪蛋白(脱脂奶粉)30g，K2HPO41.4g，KH2PO40.7g，NaCl0.5g，MgSO40.1g，琼脂20g，pH7.0种子培养基(g/L):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.2发酵培养基(g/L):整根羽毛10g，K2HPO41.4g，KH2PO40.7g，NaCl0.5g，MgSO40.1g，pH7.0。1.3拟蕈状芽孢杆菌的分离及筛选1.3.1富集：10g土样加入80mL的无菌水中，震荡静止后取上清10mL于100mL富集培养基，37℃180r/min培养48h。1.3.2初筛：取富集培养液，用无菌水做梯度稀释(10-1～10-7)并混匀，每个稀释梯度的菌液取100uL均匀涂布于脱脂奶粉平板上，置于30℃恒温培养箱中倒置培养72h(时间不定，定期观察)，挑选蛋白水解透明圈较大而明显的单菌落多次划线纯化，接斜面培养基保存备用。1.3.3复筛：挑取初筛单菌落至种子培养基，30℃，200r/min的摇床培养15h，将培养好的种子按照1％(v/v)的接种量接种到羽毛发酵培养基，30℃，200r/min的摇床培养，发酵48h，离心发酵液，取上清液测定角蛋白酶活性和蛋白含量进行菌种筛选。1.4菌株(拟蕈状芽孢杆菌)鉴定方法1.4.1菌株(拟蕈状芽孢杆菌)形态学及生理生化特性显微镜观察，革兰氏染色，生理生化实验参考细菌系统鉴定手册。1.4.2产角蛋白酶菌株(拟蕈状芽孢杆菌)的分子鉴定16SrDNA鉴定，用牙签从平板挑少量菌体加入30uL10％(pH7.0)chelex-100试剂，使用PCR仪设定好的程序裂解15min(100℃)冷却至室温。迷你离心机离心8min，吸取1uL作为PCR扩增模板。采用16SrDNA基因的通用引物配成25uL体系进行PCR反应。上游引物(1492R):5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,下游引物(27F)5’--3’。1％的琼脂糖电泳，测序，序列比对BLAST，该核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该一种拟蕈状芽孢杆菌保藏编号为GDMCC60687，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2019年6月13日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类类别为Bacillusparamycoides。1.5菌株降解、利用羽毛角蛋白能力的检测1.5.1菌株降解羽毛的定性测定直接观察法：将所分离的菌株(拟蕈状芽孢杆菌)接入含完整羽毛的液体发酵培养基中发酵培养，测培养液中羽毛的降解程度。1.5.2菌株降解羽毛的定量测定1.5.2.1可溶性蛋白的测定A蛋白质含量标准曲线的绘制：以牛血清蛋白(BSA)作为标准蛋白，精确配制成200ug/mL的稀释液，取7个2.0mL的无菌离心管，分别向其中加入成梯度浓度的标准蛋白稀释液，再加去离子水补足到200uL，配制成7个不同浓度梯度的标准蛋白(0、5、10、15、20、25、30ug/mL)，分别从上述标线蛋白溶液中取30uL注入96孔板中，每个浓度做3个平行，然后加入200uL考马斯亮蓝，混匀，放置2min后置于酶标仪上测定595nm波长处的吸光值，做标准蛋白浓度A595值标准曲线，进行线性回归，得到标准曲线和线性回归方程。B.发酵上清液可溶性蛋白含量测定发酵液离心(8000r/min，10min，4℃)得到上清液，经过适当稀释后取30uL样液，加入200uL考马斯亮蓝，混匀，放置2min后测定D595值，并通过标准曲线查得溶液的蛋白浓度。本专利技术的有益效果是：本专利技术的提供一种拟蕈状芽孢杆菌且提供其基因序列，另外利用了该种一种拟蕈状芽孢杆菌来降解羽毛，降解效率高且降解前不需要对羽毛进行前处理，降解的过程不会对环境造成污染。附图说明图1是本专利技术一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛实验图图2是本专利技术一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛后检验蛋白的检验报告图3是本专利技术一种拟蕈状芽孢杆菌降解羽毛后检验氨基酸的检验报告图4是本专利技术羽毛降解过程中生物量、产酶及蛋白浓度曲线具体实施方式以下结合附图描述本专利技术的实施结构。为了更为清楚的解释本专利技术的目的和技术方案以及要点，结合附图对本专利技术进一详细的说明。此处描述的具体的实施方法仅仅以解释本专利技术。如图1至图4所示，本专利技术的技术方案为：本专利技术所采用的材料和实验方法包括以下步骤：1材料和方法1.1实验材料北海养海鸭场内废弃羽毛堆积处采土样。家禽市场收集的鸡羽毛，用水洗净，烘干至衡重。1.2培养基LB营养培养基(g/L)：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂20g，pH7.2～7.5富集培养基(g/L)：酵母粉1g，NaCl0.5g，K2HPO41g，MgSO40.1g，未剪碎的羽毛少量，pH7.0初筛培养基(g/L)：酪蛋白(脱脂奶粉)30g，K2HPO41.4g，KH2PO40.7g，NaCl0.5g，MgSO40.1g，琼脂20g，pH7.0种子培养基(g/L):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.2发酵培养基(g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟蕈状芽孢杆菌，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟蕈状芽孢杆菌，其核苷酸序列为如SEQIDNO.1所示。


2.一种拟蕈状芽孢杆菌，其特征在于：分类类别为Bacillusparamycoides，保藏编号为GDMCC60687...

【专利技术属性】
技术研发人员：申乃坤，姜明国，杨立芳，朱英芝，王金子，丰景，王一兵，杨梦莹，
申请(专利权)人：广西民族大学，
类型：发明
国别省市：广西;45