本发明专利技术公开一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQ NO.1。本发明专利技术通过筛选、实验验证获得一段能够代表单增李斯特菌的特异性表面蛋白片段，以这一段特异性表面蛋白片段作为抗原序列采用细胞融合得到阳性细胞株，经过三轮亚克隆后，利用间接ELISA法检测阳性菌株并检测其分泌抗体与其他食源性致病菌株的交叉反应，获得特异性融合细胞株，最终得到了效价高、特异性好的一株单克隆杂交瘤细胞，制备了鼠单克隆抗体，效价为810000，特异性良好。本发明专利技术的单克隆抗体灵敏度较高，特异性好，稳定性强。
An antigen, monoclonal antibody, polyclonal antibody and method for preparing monoclonal antibody of Listeria monocytogenes
【技术实现步骤摘要】
一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法
本专利技术属于单增李斯特菌的检测
，尤其是一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法。
技术介绍
单增李斯特菌属于李斯特菌属，革兰氏染色阳性菌、兼性胞内寄生菌，两端钝圆且无芽孢，不产生荚膜。需氧及兼性厌氧，最适生长温度为30-37℃，嗜冷、耐酸、耐碱、耐高浓度盐，耐热性强，灭菌需要60℃加热20min或70℃加热5min。单增李斯特菌是一种人畜共患食源性致病菌，能导致败血症、脑膜炎、胃肠炎、脑脊髓炎及肺炎等，病死率高达20-30％，新生儿、孕妇及免疫功能不足人群更容易受到感染。由于巴氏杀菌奶受到污染，2007年美国马萨诸塞州发生一起单增李斯特菌感染疾病暴发事件，造成5人感染，导致3人死亡。单增李斯特菌广泛分布于自然环境中，主要存在于土壤、蔬菜、肉制品、乳制品、饲料及冷冻水产品中等。受到感染的食品严重威胁人类的安全，因此，一种快速、简便、灵敏的检测方法对于提高单增李斯特菌的检验速度和准确性十分重要，以及时处理受到污染的食品，保证食品安全的进入流通领域，将危害消费者生命安全的风险降到最低。单增李斯特菌主要检测方法包括细菌分离鉴定法、分子生物学检测方法及免疫学检测方法。传统的检测方法检测周期长并且操作复杂，需要分离培养、镜检观察、生化鉴定等多个步骤，已经越来越不能满足快速检测的需求。分子生物学检测技术具有检测快速、灵敏、特异的特点，但是对实验室和相关工作人员的要求较高。免疫学检测技术具有灵敏度高、特异性强、价格低廉、方便快捷等优点，在食源性致病菌的检测方面具有重要的应用价值。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQNO.1：IAPELYNITDEIAKFSSEKTALIWKNEHGETKTWSYHHLLEQANKFANVAKDAGIKKGDHVIVMTPRLLETYAIYMGLWKAGAIIIPASELLKAHDLEYRIHHANVKAIVSYNGMTAEFDKIESIPSVSKKIIVGDKLSGWEQYETLMEAAPTEFERVETSRDDACLLAFTSGTTGNPKGVVHIHGWGYAHIRIAADH。利用如上所述的抗原制备的单克隆抗体。利用如上所述的抗原制备的多克隆抗体。.而且，所述多克隆抗体是由所述抗原免疫动物后制备得到的。如上所述的单克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。如上所述的多克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到单克隆抗体。一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到多克隆抗体。一种利用如上所述的单克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述单克隆抗体作为捕获抗体。一种利用如上所述的多克隆抗体的单增李斯特菌的免疫检测方法，所述多克隆抗体作为检测抗体。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术通过筛选、实验验证获得一段能够代表单增李斯特菌的特异性表面蛋白片段，以这一段特异性表面蛋白片段作为抗原序列采用细胞融合得到阳性细胞株，经过三轮亚克隆后，利用间接ELISA法检测阳性菌株并检测其分泌抗体与其他食源性致病菌株的交叉反应，获得特异性融合细胞株，最终得到了效价高、特异性好的一株单克隆杂交瘤细胞，制备了鼠单克隆抗体，效价为810000，特异性良好。本专利技术的单克隆抗体灵敏度较高，特异性好，稳定性强。2、本专利技术还针对所获得的特异性表面蛋白片段制备了多克隆抗体，基于制备的单克隆抗体与多克隆抗体，本专利技术还公开了以此为基础建立的快速、灵敏、特异性高的单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法，利用鼠单克隆抗体作为捕获抗体，兔源多克隆抗体作为检测抗体，0.5％脱脂乳粉在37℃下封闭1.0h，酶标羊抗兔抗体作用时间为0.5h，检测限为104CFU/mL，选取5株种内单增李斯特菌、5株李斯特菌属内菌种，以及5株非李斯特菌进行特异性检测，检测结果显示特异性良好。为市场上产品中单增李斯特菌的检测提供了可靠的方法，并且为进一步试纸条检测方法的开发奠定了基础。附图说明图1为本专利技术中抗原在大肠杆菌中重组表达后纯化的结果图；其中，M：marker，1：粗蛋白，2：纯化后；图2为本专利技术中捕获抗体包被量的优化图；其中，捕获抗体包被量为a-e：0.1、0.25、0.5、0.75和1.0μg/孔；图3为本专利技术中封闭液种类的优化图；其中，a：0.5％脱脂乳粉，b：0.5％BSA，c：0.5％明胶；图4为本专利技术中检测抗体稀释倍数的优化图；其中，a：1：50，b：1：100，c：1：200，d：1：400；图5为本专利技术中单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的标准曲线图；图6为本专利技术中单增李斯特菌双抗夹心ELISA检测方法的特异性图。具体实施方式下面详细叙述本专利技术的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本专利技术中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，所述抗原的氨基酸序列为SEQNO.1：IAPELYNITDEIAKFSSEKTALIWKNEHGETKTWSYHHLLEQANKFANVAKDAGIKKGDHVIVMTPRLLETYAIYMGLWKAGAIIIPASELLKAHDLEYRIHHANVKAIVSYNGMTAEFDKIESIPSVSKKIIVGDKLSGWEQYETLMEAAPTEFERVETSRDDACLLAFTSGTTGNPKGVVHIHGWGYAHIRIAADH。利用如上所述的抗原制备的单克隆抗体。利用如上所述的抗原制备的多克隆抗体。.较优地，所述多克隆抗体是由所述抗原免疫动物后制备得到的。如上所述的单克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。如上所述的多克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。例如，在单增李斯特菌的试剂盒、试纸条以及其它检测产品中的应用。一种利用如上所述的单克隆抗体检测或辅助检测单增李斯特菌的方法，所述方法中使用到单克隆抗体。一种利用如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，其特征在于：所述抗原的氨基酸序列为SEQ NO.1。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于制备单增李斯特菌单克隆抗体的抗原，其特征在于：所述抗原的氨基酸序列为SEQNO.1。
2.利用如权利要求1所述的抗原制备的单克隆抗体。
3.利用如权利要求1所述的抗原制备的多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体是由所述抗原免疫动物后制备得到的。
5.如权利要求2所述的单克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品方面中的应用。
6.如权利要求3或4所述的多克隆抗体在检测或辅助检测单增李斯特菌的检测产品...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜欣军，宋佳蓉，张宸宁，李萍，杜婷，王硕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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