一种检测唾液链球菌的引物组和检测体系及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测唾液链球菌的引物组及其检测体系和应用；所述引物组合物为针对肠道细菌的16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3‑5个。基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

A primer set and detection system for detection of Streptococcus salivarius and its application

【技术实现步骤摘要】
一种检测唾液链球菌的引物组和检测体系及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种检测唾液链球菌的引物组及其检测体系和应用。
技术介绍
结直肠癌是世界第三大常见癌症，每年有120万患者被确诊为CRC，并造成每年60万人死亡，2015年中国结直肠癌发病率占全球24.3%，死亡数占全球22.9%，研究认为至少80%的大肠癌有大肠腺瘤演变而来，历时约10-15年，积极诊治大肠腺瘤是控制、减少大肠癌的重要途径，有报道指出，早期发现和治疗可使大肠癌的5年生存率高达90%。但是在我国实际上超过80%的患者确诊时已发展到中晚期，早期诊断率只有10%。因此，重视大肠癌的早期发现对于其预后的改善极其重要。目前国内外常用的结直肠癌检测方法主要有结肠镜检、潜血试验（FOB）和粪便免疫化学检查（FIT）。目前最广泛最可靠的检查方法是结直肠镜检，然而，此检查属于侵入性操作，有一定的不适和并发症，患者体验差。FOB一般用于对无症状人群大肠癌和腺瘤的筛查，需要多次检测，且检出率较低。FIT利用单克隆或多克隆抗体直接检测人粪便样本中的血红蛋白，不受进食食物影响，但是FIT一次检测检出癌症的敏感性为80%，检测出高度不典型腺瘤的敏感性仅为20%-30%，为提高检出率，需要重复进行。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术通过对粪便或唾液样本中唾液链球菌（Streptococcussalivarius，Ss）的检测评估结直肠癌发病率的方法，本专利技术包含了唾液链球菌的特异性引物，通过添加随机碱基的方法，提高引物组合物与微生物组合的特异性和准确性。本专利技术采用的技术方案如下：第一方面，唾液链球菌引物组设计，本专利技术提供了一种鉴定粪便和唾液中唾液链球菌的引物组，所述引物组为针对细菌16SrRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基2-5个。通过调控随机碱基的数量，提高检测特异性。微生物16SrRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物，另外相对于其他可变区，V3-V4区可覆盖98%以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物长度的要求。根据这个条件，可以设计一对鉴定粪便样本中所有微生物总量的引物。优选地，所述引物组包括唾液链球菌引物和总菌引物。优选地，所述引物长度为18-30bp，例如可以是18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp。本专利技术中，专利技术人设计引物组并验证其特异性，比对出的序列均为细菌16SrRNA序列或全基因组序列。用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上NμcleotideBLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90%。确定的唾液链球菌引物对为：SEQIDNO.1-6，总菌引物为：SEQIDNO.7-10.确定条件：1）扩增产物单一且大小与预期一致；2）扩增产物测序结果与预期产物序列相似度高；3）融解曲线峰形为单峰且集中；4）扩增效率在90%-105%之间。第二方面，本专利技术提供一种检测体系，所述检测体系包含第一方面所述的引物组，以及DNA、qPCRSYBRGreenMix和ddddH2O。本专利技术中，专利技术人对反应体系进行不断优化，以体系中VazymeChamQΜniversalSYBRqPCRMasterMix试剂推荐的反应体系为基础，测试体系中模板DNA的添加量；通过Qμbit测定样本DNA浓度，设置DNA起始量梯度进行实验，Ct值≦35对应的DNA起始量为可接受范围。优选地，所述引物组的引物的浓度为0.25-1.25ng/μL，例如可以是0.25ng/μL、0.30ng/μL、0.40ng/μL、0.50ng/μL、0.60ng/μL、0.70ng/μL、0.80ng/μL、0.90ng/μL、1.00ng/μL、1.10ng/μL或1.25ng/μL。优选地，所述DNA的添加量为1.00-1.25ng/μL，例如可以是1.00ng/μL、1.05ng/μL、1.10ng/μL、1.15ng/μL、1.20ng/μL或1.25ng/μL。本专利技术中，专利技术人根据第一方面提供的引物组的正反向引物的Tm值±5℃设置温度梯度进行qPCR实验，根据融解曲线及产物电泳图反复摸索验证，各步骤各条件相互配合，选择融解峰单一集中且电泳条带单一明亮的温度，最终确定唾液链球菌的引物Ss-P1最适退火温度为60℃，引物Ss-P2和Ss-P3最适退火温度为55℃。优选地，所述检测体系的检测条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃1min，45个循环。体系优化完成后，专利技术人通过标准曲线测试反应性能：以已知浓度的质粒为模板，10倍梯度稀释制作标准曲线，若曲线的扩增效率达到90-105%，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近，则说明反应体系性能良好。本专利技术通过设计并验证得到特异性的引物组，基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。第三方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组。优选地，所述试剂盒还包括qPCRSYBRGreenMix、ddH2O和PCR反应液。优选地，所述PCR反应液包括10-75mmol/L的Tris-HCl、10-40mmol/L的硫酸铵、1-5.0mmol/L的MgCl2和100-500μmol/L的dNTPs。优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；优选地，所述阴性质控品包括无菌水；优选地，所述阳性质控品包括具核梭杆菌基因组DNA。优选地，所述PCR结果的判定如下：A）实验有效性：（1’）阴性对照：无典型S型扩增曲线；（2’）阳性对照：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30；（3’）检测样本的Ct值＜40；B）结果判读：细菌相对含量=2-Ct；其中Ct=Ct细菌-Ct总菌。第四方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的引物组、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的检测体系用于制备检测结直肠癌的药物和/或试剂的应用。本专利技术提供的引物组特异性好，准确性高；本专利技术提供的引物组制备的检测体系性能良好，曲线的扩增效率达到90-105%，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近；制备得到的试剂盒用于检测时操作简便，易于推广。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合本专利技术的优选实施例来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测唾液链球菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括唾液链球菌引物对：SEQ ID NO.1-6。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测唾液链球菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括唾液链球菌引物对：SEQIDNO.1-6。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括总菌引物对：SEQIDNO.7-10。


3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qPCRSYBRGreenMix、ddddH2O和PCR反应液。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括10-75mmol/L的Tris-HCl、10-40mmol/L的硫酸铵、1-5.0mmol/L的MgCl2和100-500μmol/L的dNTPs。


6.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；
优选地，所述阴性质控品包括无菌水；

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永亮，穆延召，杨敏，王一伟，
申请(专利权)人：苏州普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32