一种测序方法技术

本发明专利技术实施例涉及基因测序领域，公开了一种测序方法，包括:提供测序芯片以及位于测序芯片上的开口限定层，开口限定层内具有至少一个开口，开口下方设置有检测模块，且开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；在待测核酸分子上修饰与核酸接头碱基互补配对的核酸序列；向开口内加入扩增反应液及待测核酸分子，待测核酸分子在开口内的核酸接头处进行核酸扩增反应流程；在核酸扩增反应流程之后，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列。本发明专利技术中，测序方法不再依赖微球载体，降低了测序成本；同时过程中不涉及使用微球，提高了测序通量。

A sequencing method

【技术实现步骤摘要】
一种测序方法
本专利技术实施例涉及基因测序领域，特别涉及一种测序方法。
技术介绍
基因测序技术作为最重要的分子生物学分析方法之一，不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。基因测序技术的发展经历了几个重要阶段：经典的手工测序，主要依赖于一些生物化学方法和电泳分离技术,包括Sanger测序和DNA化学降解测序；第一代测序技术，主要基于Sanger法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化；第二代测序技术，主要包括Solexa测序、Solid平台、454测序，及第2.5代测序技术中IonTorrent，被称为新一代测序，它们的测序原理不完全相同，但均实现了更高的通量。然而，本专利技术的专利技术人发现现有技术中至少存在如下问题：目前，454焦磷酸测序平台和IonTorrent测序平台所涉及的测序方法依赖微球载体，需要将接头、引物及DNA片段附着在微球上，但微球的尺寸限制了半导体芯片的阵列的密度及规模，从而在一定程度上限制了测序的通量，并且微球的制作、文库制备、微球加载至阵列中的步骤繁琐，成本昂贵，影响了测序的单次成本。
技术实现思路
本专利技术实施方式的目的在于提供一种测序方法，使得测序方法不再依赖微球载体，解决了使用微珠法进行测序时工艺的复杂性、半导体生物芯片集成度等问题，进一步提高通量、降低测序成本。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种测序方法，包括以下步骤：提供测序芯片以及位于测序芯片上的开口限定层，开口限定层内具有至少一个开口，开口下方设置有检测模块，且开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；在待测核酸分子上修饰与核酸接头碱基互补配对的核酸序列；向开口内加入扩增反应液及待测核酸分子，待测核酸分子在开口内的核酸接头处进行核酸扩增反应流程；在核酸扩增反应流程之后，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列。本专利技术实施方式相对于现有技术而言，通过将核酸接头直接修饰在测序芯片上，使得测序不再依赖微球载体，创造性地解决了依赖微球的测序方法的复杂性；同时由于测序没有使用微球，半导体生物芯片的集成度可以做的更高，提高测序通量，降低了测序成本。另外，开口限定层内具有至少两个开口，至少两个开口构成一个开口阵列。这样做的目的是：通过多个开口构成的开口阵列，通过将各个开口内的测序数据进行拼接，得到整个待测核酸分子的核酸序列。在多个开口内进行并行测序，进一步提高测序通量。另外，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及与核苷酸的种类对应的检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列，具体包括：确定不同种类的核苷酸加入开口的顺序；按不同种类的核苷酸加入开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据检测模块的检测结果，测定待测核酸分子在该位点的核酸序列；在测定待测核酸分子在该位点的核酸序列后，重新按不同种类的核苷酸加入开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据检测模块的检测结果，测定待测核酸分子所有位点的核酸序列。另外，测定待测核酸分子所有位点的核酸序列，具体包括：将至少两个开口的待测核酸分子片段的核酸序列进行数据拼接，得到待测核酸分子的核酸序列。另外，向开口内加入扩增反应液及待测核酸分子，待测核酸分子在核酸接头处进行核酸扩增反应流程，具体包括：向开口内加入扩增反应液，直至扩增反应液覆盖开口限定层顶部；待测核酸分子在开口内的核酸接头处完成一次核酸扩增反应流程；核酸扩增反应流程包括：向开口中加入第一类聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，对测序芯片及开口限定层进行热处理。这样做的目的是：对待测核酸分子进行扩增反应，得到大量的待测核酸分子，为后续的基因测序做准备。另外，向开口内加入扩增反应液，直至扩增反应液覆盖开口限定层顶部后，进行所述扩增步骤之前，还包括：向开口上方通入替换液，置换掉高于开口限定层的顶部的扩增反应液；替换液与扩增反应液互不相溶。这样做的目的是：通过将开口上方的扩增反应液替换成替换液，将开口分割成独立的扩增反应腔室，避免了不同开口内待测核酸分子之间的串扰，使后续的测序的结果更加准确。另外，热处理包括：程序性升温和降温处理或恒温加热处理。另外，核酸接头的种类为一种，核酸扩增反应过程中，待测核酸分子的一端与核酸接头通过碱基互补配对连接。另外，核酸接头的种类为多种，核酸扩增反应过程中，待测核酸分子的两端分别与两种不同的核酸接头通过碱基互补配对连接形成桥状结构。这样做的目的是：通过待测核酸分子与多种接头形成桥的结构，使得待测核酸分子被固定在开口中，避免了不同开口内的待测核酸分子之间的串扰问题，使后续的测序的结果更加准确。另外，所述检测模块的检测结果，具体包括：所述检测模块通过检测到氢离子的信号变化，测定所述待测核酸分子的核酸序列；其中，氢离子为核苷酸结合所释放的氢离子。相较于现有技术，本专利技术对测序方法进行改进，使测序不再依赖于微球载体，就可避免微球的制作、文库制备、微球加载至半导体芯片的阵列中的步骤繁琐、成本较高的问题；同时可以将半导体芯片的阵列密度及规模做的更大，进一步提高测序通量。附图说明一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。图1是本专利技术第一实施例所涉及的测序方法的流程图；图2是本专利技术第一实施例所涉及的测序方法中的装置剖面图；图3是本专利技术第一实施例所涉及的测序方法中的开口限定层的俯视图；图4是本专利技术第一实施例所涉及的测序方法中测序方法的具体过程；图5是本专利技术第二实施例所涉及的测序方法的流程图；图6是本专利技术第二实施例所涉及的测序方法中形成扩增反应腔室的方法；图7是本专利技术第三实施例所涉及的测序方法的流程图；图8是本专利技术第三实施例所涉及的测序方法中的开口剖面图；图9是本专利技术第四实施例所涉及的测序方法中的开口剖面图。具体实施方式目前，454焦磷酸测序平台和IonTorrent测序平台所涉及的测序方法依赖微球载体，需要将接头、引物及DNA片段附着在微球上，但微球的尺寸限制了半导体芯片的阵列密度及规模，从而在一定程度上限制了测序的通量，并且微球的制作、文库制备、微球加载至测序芯片阵列中的步骤繁琐，成本昂贵，影响了测序的单次成本。为解决上述问题，本专利技术实施例提供一种测序方法，对测序方法进行改进，使测序不再依赖于微球载体，就可避免微球的制作、文库制备、微球加载至测序芯片的阵列中的步骤繁琐、成本较高的问题；同时可以将测序芯片的阵列密度及规模做的更大，进一步提高测序通量。为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施方式中，为了使读者更好地理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测序方法，其特征在于，包括：/n提供测序芯片以及位于所述测序芯片上的开口限定层，所述开口限定层内具有至少一个开口，所述开口下方设置有检测模块，且所述开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；/n在待测核酸分子上修饰与所述核酸接头碱基互补配对的核酸序列；/n向所述开口内加入扩增反应液及所述待测核酸分子，所述待测核酸分子在所述开口内的所述核酸接头处进行核酸扩增反应流程；/n在所述核酸扩增反应流程之后，依次向所述开口内加入预设种类的核苷酸，且基于所述核苷酸的种类以及所述检测模块的检测结果，测定所述待测核酸分子的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种测序方法，其特征在于，包括：
提供测序芯片以及位于所述测序芯片上的开口限定层，所述开口限定层内具有至少一个开口，所述开口下方设置有检测模块，且所述开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；
在待测核酸分子上修饰与所述核酸接头碱基互补配对的核酸序列；
向所述开口内加入扩增反应液及所述待测核酸分子，所述待测核酸分子在所述开口内的所述核酸接头处进行核酸扩增反应流程；
在所述核酸扩增反应流程之后，依次向所述开口内加入预设种类的核苷酸，且基于所述核苷酸的种类以及所述检测模块的检测结果，测定所述待测核酸分子的核酸序列。


2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述开口限定层内具有至少两个开口，所述至少两个开口构成一个开口阵列。


3.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于，所述依次向所述开口内加入预设种类的核苷酸，且基于所述核苷酸的种类以及所述检测模块的检测结果，测定所述待测核酸分子的核酸序列，具体包括：
确定不同种类的核苷酸加入所述开口的顺序；
按所述不同种类的核苷酸加入所述开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据所述检测模块的检测结果，测定所述待测核酸分子在该位点的核酸序列；
在测定所述待测核酸分子在该位点的核酸序列后，重新按所述不同种类的核苷酸加入所述开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据所述检测模块的检测结果，测定所述待测核酸分子所有位点的核酸序列。


4.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，所述测定所述待测核酸分子所有位点的核酸序列，具体包括：
将至少两个所述开口的待测核酸分子片段的核酸序列进行数据拼接，得到所述待测核酸分子的核酸序列。

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【专利技术属性】
技术研发人员：闫哲，吴东平，孙鹏，景奉香，
申请(专利权)人：上海小海龟科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31