一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E，pH 7.0条件下催化酶活性分别提高238％、244％。pH 4.5条件下处理12h酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。因此，本发明专利技术提供的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体N35D、A179E具有较好的酶学性质。

A L-aspartate \u03b2 - decarboxylase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程

技术介绍
L-丙氨酸是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的原料；在食品领域，L-丙氨酸具有甜味，能与谷氨酸钠制成混合调味品，可调制并明显改善食品风味，而不破坏食品原有的风味；在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6和L-氨基丙醇(盐酸左氧氟沙星合成前体)的主要原料；同时，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的主要成分，也是心肌功能增强剂。在化学合成生产中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常见思路，但该方法存在产品质量差、合成路线长、收率低、成本高、环境污染严重等缺点，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和发酵法制备L-丙氨酸已成为工业生产上主要采用的方法。目前用于制备L-丙氨酸的生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，敲除次级代谢产物编码基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，获得生产L-丙氨酸菌株，在培养微生物过程中合成L-丙氨酸；周丽等以野生型大肠杆菌为出发菌株，敲除代谢产物合成途径编码基因以及丙氨酸消旋酶编码基因，将L-丙氨酸脱氢酶基因转入缺陷型菌株中获得目的菌株，该菌株发酵生产L-丙氨酸在摇瓶水平产量可达67.2g/L(引用文献：周丽，邓璨，崔文暻，刘中美，周哲敏.温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L丙氨酸[J].微生物学通报,2015,42(11):10.)。另一种方法是生物酶法，即通过表达L-天冬氨酸β-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去β-羧基生成L-丙氨酸。编码L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因Asd被发现广泛存在于假分枝杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、醋酸杆菌、产气荚膜菌等微生物中。目前发现的L-天冬氨酸β-脱羧酶大多具有较差的酸稳定性，在中性条件(pH7.0)下催化活性较低。徐虹等人通过诱变获得一株具有L-天冬氨酸β-脱羧酶活性的假单胞菌，对底物L-天冬氨酸催化转化率接近100％，但需要5天进行催化反应，时间过长(引用文献：徐虹,王雪根,刘济瑞,等.利用假单胞菌天冬氨酸_脱羧酶高效生产L_丙氨酸[J].南京化工学院学报,1995,17(1).)；Wang等人在大肠杆菌异源表达Pseudomonassp.ATCC19121来源的Asd酶，该酶比酶活为280U/mg，比酶活较低(引用文献：WangN-C,LeeC-Y.Molecularcloningoftheaspartate4-decarboxylasegenefromPseudomonassp.ATCC19121andcharacterizationofthebifunctionalrecombinantenzyme[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2006,73(2):339-348.)。因此，提供一种高产L-丙氨酸的方法、一种酶活更高、酸稳定性更高的L-天冬氨酸β-脱羧酶，对于工业应用生产L-丙氨酸具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决这些问题，本专利技术通过对编码抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因进行突变，构建得到两个酸稳定性提高的突变体N35D、A179E。本专利技术的第一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸β-脱羧酶含SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供编码上述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。本专利技术的第三个目的是提供含上述基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的细胞。本专利技术的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达上述的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET28a。本专利技术的第六个目的是提供一种制备L-天冬氨酸β-脱羧酶的方法，将表达所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35-37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20-30℃诱导15-25h。本专利技术还提供所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及所述基因工程菌在制备含有L-丙氨酸的产品中的应用。本专利技术的有益效果：第一，本专利技术提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体N35D(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)、A179E(氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码其的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)，pH7.0条件下催化酶活性分别提高238％、244％。pH4.5条件下处理12h残余酶活分别剩余83.9％、85.5％，相比对照野生型酶残余酶活24.8％，突变体酸稳定性有明显提高。50℃处理3h残余酶活分别为76.7％、51.3％，相比对照酶突变体50℃处理30min残余酶活为86％，热稳定性降低较少。因此，本专利技术提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体N35D、A179E具有较好的酶学性质，有利于生物法生产β-丙氨酸。第二，本专利技术通过构建表达L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的重组大肠杆菌，获得在pH7.0条件下具有高酶活的L-天冬氨酸β-脱羧酶菌株N35D、A179E，其纯酶比酶活达793U/mg、765U/mg。将重组菌摇瓶发酵，以L-天冬氨酸钠作为底物，进行全细胞催化反应制备L-丙氨酸，L-丙氨酸的产量达26.7g/L。附图说明图1：ArASD野生型及突变型纯酶SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准，1为野生型纯化后蛋白；2为N35D纯化后蛋白；3为A179E纯化后蛋白。图2：在pH7.0时的酶活以及pH4.5条件下处理12h酶活剩余。图3：在50℃条件下孵育3h后酶的热稳定性曲线。图4：pH4.5条件下野生型菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。图5：pH4.5条件下突变菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。图6：pH7.0条件下突变菌株一次性加入高浓度底物催化效果图。具体实施方式(一)L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活的测定方法发酵液酶活测定方法：取100μL发酵后重组大肠杆菌细胞，加入100μL1mol/LL-天冬氨酸钠溶液，加入800μLpH4.5磷酸盐缓冲液，于37℃反应30min后置于100℃灭活10min。12000rpm离心2min，取上清衍生后检测L-丙氨酸产量。反应液经0.22μm微孔滤膜过滤，载入C18色谱柱进行HPLC分析。L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活测定方法：在1.5mL离心管中加入适量酶液，加入终浓度40mmol/LL-天冬氨酸钠，PLP终浓度0.5mmol/L，于37℃，pH4.5条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于，含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，其特征在于，含SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。


2.编码权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的基因。


3.含权利要求2所述基因的载体。


4.表达权利要求1所述L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体的细胞。


5.一种基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体。


6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘中美，于佳印，赵庭，周丽，崔文璟，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32