一种体细胞重编程的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种体细胞重编程的方法，包括以下步骤：准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c‑Myc的一种或多种；配置编程用培养基：在基础培养基中添加有代血清添加剂、生长因子及小分子化合物；然后往基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，得到诱导多能干细胞。本发明专利技术所述方法，极大提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。利用本发明专利技术所述方法可以在无血清的培养基中促进体细胞间充质向上皮转变，从而提高不同来源体细胞的重编程效率，为今后诱导多能干细胞在再生医学的应用提供技术支撑。

A method of somatic reprogramming and its application

【技术实现步骤摘要】
一种体细胞重编程的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体的，本专利技术涉及一种体细胞重编程的方法及其应用。
技术介绍
随着干细胞研究的深入，科学家们发现终末分化的哺乳动物细胞也是具有全能性的，成体细胞可以被重编程，改变基因表达谱从而改变它的命运，重新拥有多能性或者直接转分化变成另一种细胞。早期体细胞重编程的方法主要有两种：核移植和细胞融合，但是这两种方法仍然需要涉及到胚胎，在伦理方面受到极大的限制。2006年，日本Yamanaka实验室在重编程领域获得了突破性的研究成果，发现通过外源表达四个转录因子Sox2,Oct4,Klf4和c-Myc可以使小鼠成纤维细胞重编程为多能干细胞(iPSC)，为干细胞研究开拓了一个新的方向，并因此获得诺贝尔奖。随后的短短几年间，体细胞重编程领域的进展异常迅猛。虽然诱导多能干细胞研究初期遇到许多问题，包括外源癌基因插入，效率低下，甚至还有自体免疫反应等问题，但是各种改进方法的提出大大促进了重编程技术的机制及应用研究。通过方法改进使重编程的体细胞不仅仅是小鼠成纤维细胞，重编程技术被应用到各种物种及细胞中。科学家们还筛选出各种重编程因子组合，不仅提高了重编程效率与质量，而且还避免了癌基因的插入，并且还发展了蛋白诱导，小分子化合物诱导等方法。重编程技术的目标就是在临床上解决病人特异的多能细胞的大量获得的难题。科学家已经在实验室成功用重编程技术和基因修复技术治疗了镰刀型贫血的小鼠。虽然这个技术离临床还很遥远，但是科学家们已经成功诱导出许多单基因突变疾病的病人iPS细胞，用作药物筛选和基因修复。重编程和发育分化一样是细胞命运的改变。但是在细胞向其他细胞转变的过程中发生了什么，也是人们迫切想知道的。然而，目前如何改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程，仍有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种体细胞重编程的方法，该方法能够有效提高体细胞重编程的效率。实现上述目的的技术方案如下。一种体细胞重编程的方法，包括以下步骤：准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种；配置编程用培养基：在无血清成分的基础培养基中添加有代血清添加剂、生长因子及小分子化合物，得到无血清基础培养基；然后往无血清基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；得到配置好的编程用培养基；将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，约2天后即可使细胞发生间质向上皮转变，约8-10天后即得到诱导多能干细胞。在其中一些实施例中，所述代血清添加剂是N2、B27、KSR中的至少一种。在其中一些实施例中，所述N2的浓度为0％-1％，所述B27的浓度在0％-2％，所述KSR的浓度在0-15％，三者不同时为0。在其中一些实施例中，所述生长因子包括bFGF和Lif中的至少一种，所述小分子化合物包括维生素C。在其中一些实施例中，所述bFGF的浓度为0-10ng/ml，所述Lif的浓度为500-2000units/ml；更优选地，包括有bFGF和Lif，所述bFGF的浓度为5ng/ml，所述Lif的浓度为2000units/ml。在其中一些实施例中，所述维生素C的浓度为10-200μg/ml，更优选地，维生素C的浓度为50μg/ml。在其中一些实施例中，所述化合物是乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺中的至少一种。在其中一些实施例中，所述乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，CDP-乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，磷脂酰乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，其中三者不同时为0。在其中一些实施例中，所述乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述CDP-乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述磷脂酰乙醇胺的浓度为1mg/ml。在其中一个实施例中，所述代血清添加剂是的浓度为1％的N2。在其中一些实施例中，所述的基础培养基为Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM)，MinimalEssentialMedium(MEM)，BasalMediumEagle(BME)，F-12，RPMI1640，αMinimalEssentialMedium(αMEM)中的一种或两种以上的混合物。在其中一个实施例中，基础培养基为DMEM。在其中一些实施例中，所述体细胞表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc中一种或多种。在其中一些实施例中，所述体细胞表达Sox2，Klf4，和Oct4，不表达c-Myc。本专利技术的另一目的是提供由上述体细胞重编程的方法制备得到的诱导多能干细胞。本专利技术的专利技术人，在不同来源的表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种体细胞配合添加乙醇胺、CDP-乙醇胺、磷脂酰乙醇胺，并进一步结合优选的代血清添加剂、生长因子及小分子化合物和体细胞的特点，提供了所述体细胞重编程的方法，该方法可以很好的促进所述不同来源体细胞重编程的效率。本专利技术向无血清基础培养基中添加一种或多种化合物，可以极大提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。利用本专利技术所述方法可以在无血清的培养基中促进体细胞间充质向上皮转变，从而提高不同来源体细胞的重编程效率，为今后诱导多能干细胞在再生医学的应用提供技术支撑。附图说明图1在N2含量为1％的基础无血清培养基中添加乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率和免疫荧光及嵌合鼠实验鉴定重编程得到的诱导多能干细胞克隆具有多能性的结果示意图。图2在N2含量为1％的基础无血清培养基中添加乙醇胺可以提高小鼠尾尖成纤维细胞的重编程效率和在KSR含量为15％的基础无血清培养基中添加乙醇胺可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率的结果示意图。图3添加乙醇胺可以促进小鼠成纤维细胞间质上皮转变，促进上皮细胞标志基因表达，降低间质细胞标志基因表达的结果示意图。具体实施方式下列实施例举例了专利技术人的标准实验室实践，用于示例本专利技术的模式，而不应将本专利技术理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本专利技术的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。定义和技术1.除非另外指明，本专利技术的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress，Inc.)：PCR2：APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种；/n配置编程用培养基：在无血清成分的基础培养基中添加代血清添加剂、生长因子及小分子化合物，得到无血清基础培养基；然后往无血清基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；得到配置好的编程用培养基；所述代血清添加剂是N

【技术特征摘要】
1.一种体细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种；
配置编程用培养基：在无血清成分的基础培养基中添加代血清添加剂、生长因子及小分子化合物，得到无血清基础培养基；然后往无血清基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；得到配置好的编程用培养基；所述代血清添加剂是N2、B27、KSR中的至少一种，所述生长因子包括bFGF和Lif中的至少一种，所述小分子化合物包括维生素C；所述化合物是乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺中的至少一种；
将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，约2天后即可使细胞发生间质向上皮转变，约8-10天后得到诱导多能干细胞。


2.根据权利要求1所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述N2的浓度为0％-1％，所述B27的浓度在0％-2％，所述KSR的浓度在0-15％，三者不同时为0。


3.根据权利要求1所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述bFGF的浓度为0-10ng/ml，所述Lif的浓度为500-2000units/ml；更优选地，包括有bFGF和Lif，所述bFGF的浓度为5ng/ml，所述Lif的浓度为2000units/ml。


4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴国，邬毅，陈可实，
申请(专利权)人：广州再生医学与健康广东省实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44