本发明专利技术公开了一种提高2C‑like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，第一步是从小鼠ESCs培养体系中去除胎牛血清，使小鼠ESCs仍保持原有的多能性特征。第二步是利用视黄酸（RA）在不含有胎牛血清的培养液中提高小鼠ESCs中2C‑like细胞的比例，结果从对照组的0.2%提高到3.3%。本发明专利技术利用特定的诱导方法提高了小鼠ESCs中2C‑like细胞比例，并通过实验手段验证了小鼠ESCs在不含有胎牛血清的培养液中2C‑like基因表达水平和蛋白水平，对哺乳动物全能干细胞研究提供新思路。
Culture medium and culture method of mouse embryonic stem cells to enhance 2C like cells
【技术实现步骤摘要】
提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法
本专利技术涉及小鼠胚胎干细胞诱导培养液，尤其是一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法。
技术介绍
哺乳动物合子基因组激活（ZGA）是胚胎发生的关键步骤，发生在小鼠的1-2细胞阶段和人类的4-8细胞阶段，这一阶段对于哺乳动物早期胚胎发育和全能性的形成具有重要意义。在小鼠ESCs中含有部分（小于1%）异质性细胞，即类似2-细胞期胚胎样细胞（2C-like细胞）。2C-like细胞不仅可以表达ZGA转录本，而且具有与2细胞胚胎相似的表观遗传特征。此外，小鼠ESCs中的2C-like细胞在体内发育状态下可同时贡献胚胎和胚外组织中。所以这部分2C-like细胞是体外进行全能性干细胞研究的珍贵模型。但是到目前为止还没有在化学成分明确的培养条件下维持小鼠ESCs中的2C-like状态细胞的维持与自我更新。因此，有效提高哺乳动物ESCs中2C-like细胞比率是展开后续研究的重中之重。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液及小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，通过本方法，能够得到高比例的2C-like细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案包括以下步骤：一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：N2细胞培养添加剂2-3ml<br>B27细胞培养添加剂4-6ml牛血清白蛋白20-30mg非必需氨基酸4-6ml左旋谷氨酰胺4-6mlβ巯基乙醇0.5-2ml青霉素链霉素4-5mlPD03259011.0mMCHIR990213.0mM白血病抑制因子LIF500-1500U/ml视黄酸RA5-15mM基础培养液余量所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。优选，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：基础培养液DMEM/F12238.0ml基础培养液Neurobasal238.0mlN2细胞培养添加剂2.5mlB27细胞培养添加剂5.0ml牛血清白蛋白25.0mg非必需氨基酸5.0ml左旋谷氨酰胺5.0mlβ巯基乙醇1.0ml青霉素链霉素5.0mlPD03259011.0mMCHIR990213.0mM白血病抑制因子LIF1000U/ml视黄酸RA10.0mM。一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，包括以下步骤：（1）选用N2B27+2i/LIF培养液培养的小鼠胚胎干细胞，即2i/L-ESCs，在37℃、5%CO2浓度状态下2i/L-ESCs呈边缘整齐的三维穹顶式细胞克隆形态；（2）取步骤（1）得到的1x105个小鼠ESCs转移至上述的诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA中，在37℃、5%CO2浓度条件下诱导培养48小时，获得2C-like细胞。所述小鼠胚胎干细胞选用2-细胞胚胎基因NELFA和MERVL标记的转基因细胞系。本专利技术的有益效果是：在化学成分明确的培养液中培养小鼠胚胎干细胞，2C-like细胞比例提高16倍（3.3%/0.2%），并验证其2-细胞期胚胎的特征。附图说明：图1是本专利技术中的N2B27+2i/LIF和N2B27+2i/LIF+RA培养液培养后的小鼠ESCs明场及荧光拍摄图片（箭头所指明点代表绿色荧光（NELFA基因驱动的绿色荧光蛋白GFP的表达）代表N2B27+2i/LIF+RA培养液可显著提高ESCs中2C-like细胞的比例）。图2是将图1中的ESCs用流式细胞仪技术计算ESCs中2C-like细胞百分比。图3是本专利技术中的实时荧光定量PCR检测2-细胞期胚胎特有基因表达水平检测图（结果显示，RA处理后2-细胞期胚胎特有基因表达水平显著提高）。图4是本专利技术中的蛋白免疫印迹法（Westonblot）检测ESCs中2-细胞期胚胎特有蛋白水平（Zscan4）检测图。图5是本专利技术中的免疫荧光染色技术检测ESCs中2-细胞期胚胎特有蛋白水平（Zscan4）检测图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：本专利技术的提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：N2细胞培养添加剂（购自Gibco，货号：17502-048）2-3mlB27细胞培养添加剂（购自Gibco，货号：17504-044）4-6ml牛血清白蛋白（购自Sigma，货号：A3311）20-30mg非必需氨基酸（购自Gibco，货号：11140-035）4-6ml左旋谷氨酰胺（购自Gibco，货号：35050-061）4-6mlβ巯基乙醇（购自Gibco，货号：21985-023）0.5-2ml青霉素链霉素（购自Sigma，货号：010M0650）4-5mlPD0325901（购自MiltenyiBiotec，货号：130-103-923）1.0mMCHIR99021（购自MiltenyiBiotec，货号：130-103-926）3.0mM白血病抑制因子LIF（购自Millipore，货号：ESG1106）500-1500U/ml视黄酸（RA）（购自Sigma，货号：R2625）5-15mM。基础培养液余量。所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12（购自Gibco，货号：11320-033）和基础培养液Neurobasal（购自Gibco，货号：21103-049），二者体积比为1:1。优选，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：基础培养液DMEM/F12238.0ml基础培养液Neurobasal238.0mlN2细胞培养添加剂2.5mlB27细胞培养添加剂5.0ml牛血清白蛋白25.0mg非必需氨基酸5.0ml左旋谷氨酰胺5.0mlβ巯基乙醇1.0ml青霉素链霉素5.0mlPD03259011.0mMCHIR990213.0mM白血病抑制因子LIF1000U/ml视黄酸RA10.0mM。一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养方法，包括以下步骤：（1）选用N2B27+2i/LIF培养液培养的小鼠胚胎干细胞，即2i/L-ESCs，在37℃、5%CO2浓度状态下2i/L-ESCs呈边缘整齐的三维穹顶式细胞克隆形态；（2）取步骤（1）得到的1x1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：/nN2细胞培养添加剂 2-3 ml/nB27细胞培养添加剂 4-6 ml/n牛血清白蛋白 20-30 mg/n非必需氨基酸 4-6 ml/n左旋谷氨酰胺 4-6 ml/nβ巯基乙醇 0.5-2 ml/n青霉素链霉素 4-5 ml/nPD0325901 1.0 mM/nCHIR99021 3.0 mM/n白血病抑制因子LIF 500-1500 U/ml/n视黄酸RA 5-15 mM/n基础培养液 余量/n所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。/n...
【技术特征摘要】
1.一种提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：
N2细胞培养添加剂2-3ml
B27细胞培养添加剂4-6ml
牛血清白蛋白20-30mg
非必需氨基酸4-6ml
左旋谷氨酰胺4-6ml
β巯基乙醇0.5-2ml
青霉素链霉素4-5ml
PD03259011.0mM
CHIR990213.0mM
白血病抑制因子LIF500-1500U/ml
视黄酸RA5-15mM
基础培养液余量
所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。
2.根据权利1所述提高2C-like细胞的小鼠胚胎干细胞诱导培养液，其特征在于，每500ml诱导培养液N2B27+2i/LIF+RA组成为：
基础培养液DMEM/F12238.0ml
基础培养液Neurobasal238.0ml
N2细胞培养添加剂2.5ml
B27细胞培养添加剂5...
【专利技术属性】
技术研发人员：包斯琴，吴宝江，王艳秋，李喜和，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙;15
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