一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法技术

本发明专利技术是一种免疫金标速测卡，特别涉及一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法。包括外壳，所述的外壳中设有检测卡，还包括检测区和控制区，所述的外壳的上部设有观察窗，所述的检测区和控制区分别位于观察窗中，所述的外壳中设有加样孔。可针对PCR扩增产物进行快速、现场和灵敏的检测。

A quick detection card, preparation method and detection method of nucleic acid two in one immunogold standard

【技术实现步骤摘要】
一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法
本专利技术是一种免疫金标速测卡，特别涉及一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法。
技术介绍
PCR技术可以将微量目的DNA扩增100万倍以上，从而实现对微量目的DNA分子的检测，具有敏感度高、特异性强、产率高、重复性好几快速简便等优点，被广泛应用于微生物学、考古学、法医学、及体育领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易的对目的基因进行分析和鉴定。PCR扩增产物的分析通常采用琼脂糖凝胶电泳，需要配备专门的电泳仪和凝胶成像仪，本专利技术通过对PCR的引物进行修饰，使得扩增产物不需经过电泳，直接进行检测。
技术实现思路
本专利技术主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种能直接检测两种PCR扩增产物的一种核酸二合一免疫金标速测卡、制备方法及其检测方法。本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种核酸二合一免疫金标速测卡，包括外壳，所述的外壳中设有检测卡，还包括检测区和控制区，所述的外壳的上部设有观察窗，所述的检测区和控制区分别位于观察窗中，所述的外壳中设有加样孔。作为优选，所述的检测卡包括底板，所述的底板上顺次搭接粘贴有样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述的标记垫上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体；所述硝酸纤维素膜包括包被有抗生物素抗体的检测线T1、包被有抗FITC抗体的检测线T2和包被有二抗的质控线C。作为优选，所述的标记垫上的抗地高辛抗体的涂覆量为5ng～50ng；硝酸纤维素膜上的抗生物素抗体的量为0.2μg～1.0μ；硝酸纤维素膜上的抗FITC抗体的量为0.2μg～1.0μg；作为优选，所述的标记垫上的抗地高辛抗体的涂覆量为24ng，硝酸纤维素膜上抗生物素抗体的量为0.3μg，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.45μg。作为优选，所述样品垫的大小为3mm×15mm，标记垫的大小为3mm×3mm，硝酸纤维素膜的大小为3mm×28mm，吸收垫的大小为3mm×19mm。一种核酸二合一免疫金标速测卡的制备方法，按以下步骤进行：(一)、含有检测线T1、T2和控制线C的硝酸纤维素膜的制备：1)、将生物素抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到生物素抗体溶液，作为检测线T1的包被抗体；将FITC抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.5mg/mL得到T抗原溶液，作为检测线T2的包被抗体；羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml；2)、包被：选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的生物素抗体溶液以1.0μL/cm划T1线，作为检测线T1；将浓度为1.5mg/mL的FITC抗体溶液以1.0μL/cm划T2线，作为检测线T2；浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线C；在温度为37℃的环境下，烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜；(二)、固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫的制备：1)、胶体金制备：a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒洗净后放入酸缸中浸泡24小时；取出先用自来水冲洗3～4次，再用超纯水冲洗3～4次，置于37℃烘箱中烘干备用；b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，在温度为4℃的环境中避光保存；c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀。d)胶体金的制备：量取99ml超纯水于烧杯中，加入1ml烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入2ml新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮10min，自然冷却至室温，加超纯水定容至100ml；倒入棕色瓶，在温度为4℃的环境中避光保存；得到胶体金溶液；2)、抗体标记：e)抗体的标记：取1.5ml上述步骤(二)的d)中制取好的胶体金溶液，用0.1M的K2CO3调节pH值，分别加入20ug地高辛单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入10％的BSA终止，静置30min；f)标记抗体纯化：先用低速离心上述静置产物，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀，收集上清液；再用高速离心30分钟，仔细吸去上清液，收集沉淀，用含质量百分含量为1％BSA的0.1MPBS、PH7.4进行复溶沉淀，在温度为4℃的环境中进行保存；得到地高辛抗体标记胶体金溶液，浓度为0.4mg/ml；3)、喷金：将上述步骤(二)的f)中制备的地高辛抗体标记胶体金溶液0.4mg/ml稀释到0.04mg/ml，以2.0μL/cm喷于预处理过的金标垫试纸条，烘干待用，得到固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条；(三)、核酸二合一免疫金标速测卡的组装：在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和观察孔，加样孔大小为3mm×7mm，观察孔大小为3mm×18mm；在塑料板下方从加样孔往上依次为并排粘贴的：玻璃纤维膜作为样品垫、上述步骤(二)的f)中制备的固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫试纸条，上述步骤(一)的2)中制备的包被抗原的硝酸纤维素膜和吸收垫；然后置于在环境为37℃的环境下真空干燥30min，得到核酸二合一免疫金标速测卡。作为优选，步骤(二)的a)中酸缸溶液的配比：重铬酸钾：浓硫酸：超纯水＝120g:200ml:1000ml；步骤(二)的d)中得到胶体金溶液，其中胶体金的粒径为40nm；浓度为万分之一；步骤(二)的f)中，先用低速(1500r/min)离心上述静置产物，所述的离心低速为1500r/min；再用高速离心30分钟，所述的高速离心为8500r/min；步骤(三)中金标记抗体试纸条大小为3mm×3mm，硝酸纤维素膜大小为3mm×28mm，吸收垫大小为3mm×19mm。一种核酸二合一免疫金标速测卡的检测方法，按以下步骤进行：两对核酸引物对分别修饰地高辛/生物素地高辛/FITC和地高辛/FITC，对提取的检测样本进行PCR反应；将速测卡水平放置，在加样孔中加入反应产物溶液；反应产物溶液沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，如果样品溶液中含核酸那么PCR扩增产物将与检测卡上的抗地高辛抗体结合，并与硝酸纤维素膜上的抗生物素抗体或FITC抗体结合，8-10min后，可于观察孔中观察到检测区T的颜色变化，即T出现阳性条带，一条T线说明一个阳性，两条T线说明两个都为阳性；如果样品溶液中不含对应核酸，那么检测区则观察不到阳性条带；而无论样品溶液中是否含对应核酸，当样品溶液到达硝酸纤维素膜时，检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸二合一免疫金标速测卡，包括外壳(1)，所述的外壳(1)中设有检测卡(2)，其特征在于：还包括检测区和控制区，所述的外壳(1)的上部设有观察窗(4)，所述的检测区和控制区分别位于观察窗(4)中，所述的外壳(1)中设有加样孔(3)。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸二合一免疫金标速测卡，包括外壳(1)，所述的外壳(1)中设有检测卡(2)，其特征在于：还包括检测区和控制区，所述的外壳(1)的上部设有观察窗(4)，所述的检测区和控制区分别位于观察窗(4)中，所述的外壳(1)中设有加样孔(3)。


2.根据权利要求1所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：所述的检测卡(2)包括底板(5)，所述的底板(5)上顺次搭接粘贴有样品垫(6)、标记垫(7)、硝酸纤维素膜(8)和吸收垫(9)；
所述的标记垫(7)上涂覆有胶体金标记的抗地高辛抗体；
所述硝酸纤维素膜(8)包括包被有抗生物素抗体的检测线T1(10)、包被有抗FITC抗体的检测线T2(11)和包被有二抗的质控线C(12)。


3.根据权利要求2所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：
所述的标记垫(7)上的抗地高辛抗体的涂覆量为5ng～50ng；硝酸纤维素膜(8)上的抗生物素抗体的量为0.2μg～1.0μ；硝酸纤维素膜(8)上的抗FITC抗体的量为0.2μg～1.0μg。


4.根据权利要求3所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：
所述的标记垫上的抗地高辛抗体的涂覆量为24ng，硝酸纤维素膜上抗生物素抗体的量为0.3μg，硝酸纤维素膜上抗FITC抗体的量为0.45μg。


5.根据权利要求2所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡，其特征在于：所述样品垫的大小为3mm×15mm，标记垫的大小为3mm×3mm，硝酸纤维素膜的大小为3mm×28mm，吸收垫的大小为3mm×19mm。


6.根据权利要求1所述的一种核酸二合一免疫金标速测卡的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(一)、含有检测线T1、T2和控制线C的硝酸纤维素膜的制备：
1)、将生物素抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1mg/mL得到生物素抗体溶液，作为检测线T1的包被抗体；
将FITC抗体用浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液稀释到1.5mg/mL得到T抗原溶液，作为检测线T2的包被抗体；
羊抗鼠IgG二抗溶液为将羊抗鼠IgG二抗溶于浓度为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，且羊抗鼠IgG二抗浓度为1mg/ml；
2)、包被：
选取PALL170的硝酸纤维素膜用划膜喷金机将浓度为1.0mg/mL的生物素抗体溶液以1.0μL/cm划T1线，作为检测线T1；
将浓度为1.5mg/mL的FITC抗体溶液以1.0μL/cm划T2线，作为检测线T2；
浓度为1mg/mL的羊抗鼠IgG二抗溶液以1.0μL/cm划C线，作为质控线C；
在温度为37℃的环境下，烘干24小时，待用；得到包被抗原的硝酸纤维素膜；
(二)、固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫的制备：
1)、胶体金制备：
a)准备：将500mL烧杯、20mL小烧杯、转子、棕色瓶、玻璃棒洗净后放入酸缸中浸泡24小时；
取出先用自来水冲洗3～4次，再用超纯水冲洗3～4次，置于37℃烘箱中烘干备用；
b)烧金溶液A的配置：用塑料称量匙称取1g氯金酸粉末于棕色瓶中，加入99ml超纯水充分溶解，在温度为4℃的环境中避光保存；
c)烧金溶液B的配置：称取1g柠檬酸三钠溶解于99ml超纯水中，混匀。...

【专利技术属性】
技术研发人员：武爱波，吴蔚，徐伟，杨文杰，徐炜，陶渊超，
申请(专利权)人：中科佑隆杭州食安标准科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33