一种单链DNA定量检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种单链DNA定量检测试剂盒，包括稀释缓冲液、标准品1、标准品2和荧光染料，所述的稀释缓冲液为含有0.001~0.003 wt%的Tween‑20的pH为7~8的1×TE缓冲液，所述的荧光染料为SUPER Green Ⅱ。本发明专利技术检测线性相关性好，灵敏度高，准确性好，检测值稳定时间长，且检测速度快，可以更好的满足多样品检测的需求。

A single strand DNA quantitative detection kit and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种单链DNA定量检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种单链DNA定量检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
合成的寡核苷酸用于许多分子生物学技术，例如DNA测序，定点诱变，DNA扩增和原位杂交。测量寡核苷酸和ssDNA浓度的最常用的技术是测定260nm的吸光度(A260)，该方法的主要缺点是核苷酸也有明显的信号，影响检测值，此外核酸制备中常见的污染物也可以引起干扰和测定的不敏感性。此定量方法灵敏度也不高，难以检测低浓度的样品。荧光染料可以与ssDNA结合，在特定波长的激发光的作用下，发射出荧光，在一定的ssDNA浓度范围内，荧光强度与ssDNA浓度成线性关系。因此，可以根据ssDNA与荧光染料结合后的荧光强度，检测ssDNA的浓度。ssDNAAssayKit是ThermoFisherScientific公司的一款ssDNA定量检测试剂盒，在Qubit荧光检测仪平台上使用，在200μL检测体系中，检测范围为1-200ng。试剂盒提供了浓缩的分析试剂、稀释缓冲液和预制的DNA标准品。然而使用该试剂盒，单个样本检测成本大约42元，检测成本较高。另外，使用该试剂盒，需要在加入样品30min内读取检测值，超出30min后，则检测值显著变化。一些分子诊断公司需要一次检测大量样本，从而有可能无法在30min内完成结果的读取，进而造成实验结果不准，试剂盒的这些不足降低了检测的准确性。因此，在ssDNA定量检测中，需要一种更经济、更稳定的检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的是为了克服现有技术的不足而提供一种检测值稳定时间长的单链DNA定量检测试剂盒及其制备方法和应用。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术一方面提供一种单链DNA定量检测试剂盒，包括稀释缓冲液、标准品1、标准品2和荧光染料，所述的稀释缓冲液为含有0.001～0.003wt％的Tween-20的pH为7～8的1×TE缓冲液，所述的荧光染料为SUPERGreenII。本专利技术通过特定的稀释缓冲液与特定的荧光染料的有机配合，使得本专利技术的试剂盒可以定量检测单链DNA或环化单链DNA，并且检测值的稳定时间长，从而便于研究人员一次处理大量样本，另外，本专利技术的试剂盒线性好，线性范围广。此外，专利技术人经研究发现，当采用其他稀释缓冲液，例如不含有Tween-20时，单链DNA或环化单链DNA的检测值与单链DNA或环化单链DNA的浓度的线性相关性很差；当采用其他荧光染料，例如SYBRGreenII时，无法进行测定。优选地，所述的稀释缓冲液为含有0.0015～0.0025wt％的Tween-20的pH为7.2～7.8的1×TE缓冲液，从而使得单链DNA或环化单链DNA的检测值与单链DNA或环化单链DNA的浓度的线性相关性进一步提高。优选地，所述的标准品1为含有0.001～0.003wt％的Tween-20的pH为7～8的1×TE缓冲液，从而使得单链DNA或环化单链DNA的检测值与单链DNA或环化单链DNA的浓度的线性相关性进一步提高，并且，原料与稀释缓冲液相同，从而制备简单、成本低，且干扰成分少。进一步优选地，所述的标准品1为含有0.0015～0.0025wt％的Tween-20的pH为7.2～7.8的1×TE缓冲液。优选地，所述的标准品2包括20ng/μL的碱基数为15～20个的单链寡核苷酸。进一步优选地，所述的单链寡核苷酸的碱基数为16～19个。根据一种具体且优选实施方式，所述的稀释缓冲液为含有0.002wt％的Tween-20的pH为7.5的1×TE缓冲液；所述的标准品1为含有0.002wt％的Tween-20的pH为7.5的1×TE缓冲液；所述的标准品2包括20ng/μL的碱基数为18个的单链寡核苷酸，所述的标准品2还包括溶剂，所述的溶剂为含有0.002wt％的Tween-20的pH为7.5的1×TE缓冲液，从而使得检测值偏差小于10％，相关性R2大于99％，检测灵敏度可达1ng(样品浓度0.1ng/μL，加入10μL)，与商业试剂盒ssDNAAssayKit相同，且检测值稳定时间可达120min。进一步优选地，所述的单链寡核苷酸的序列为5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′。本专利技术的第二方面是提供一所述的单链DNA定量检测试剂盒在定量检测单链DNA或环化单链DNA中的应用。本专利技术的第三方面是提供一种单链DNA或环化单链DNA的定量检测方法，将待检测的单链DNA或环化单链DNA样品利用所述的单链DNA定量检测试剂盒在Qubit荧光检测仪上进行检测。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术检测线性相关性好，灵敏度高，准确性好，检测值稳定时间长，且检测速度快，可以更好的满足多样品检测的需求。附图说明图1为SUPERGreenII检测值与理论值的线性关系。具体实施方式为更清楚体现本专利技术的目的、技术方案及优势，下面结合说明书附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例仅用以阐释本专利技术，不用于限制本专利技术。所用的实验材料来源如下：Oligo18：18碱基单链寡核苷酸，序列为：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，上海捷瑞生物工程有限公司合成；荧光染料SUPERGreenII，10000X，南京固与生物有限公司购买；片段化DNA，经过COVARIS打断的基因组DNA；MGIEasy通用DNA文库制备试剂套装(货号：1000006985)，购买于MGI；ssDNAAssayKit，购买于ThermoFisher公司。实施例1：SUPERGreenII检测值与ssDNA浓度的线性相关性及定量限的确定一、材料与方法1、稀释缓冲液的配制：稀释缓冲液为1×TE(pH7.5)，含0.002％Tween-20。配制方法如下表1：表1试剂体积(mL)20×TE(pH7.5)100TWEEN-200.04ddH2O至2000合计：2000根据以上表格，准确量取相应溶液置于2L离心管中，混合后4℃保存。2、荧光染料SUPERGreenII，10000×用稀释缓冲液按照1∶10000进行稀释。3、用稀释缓冲液作为ssDNA定量检测的标准品1。将合成的18bp单链寡核苷酸加入稀释缓冲液，配制成100μM的保存液。然后用稀释缓冲液稀释到20ng/μL，检测OD260为0.614，以此作为ssDNA定量检测的标准品2。4、制作标准曲线：取Qubit荧光检测仪专用0.5mL离心管，每个管中加入190μLSUPERGreenII，然后分别加入10μL标准品1和标准品2。盖上管盖，涡旋混匀2-3秒，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：包括稀释缓冲液、标准品1、标准品2和荧光染料，所述的稀释缓冲液为含有0.001~0.003 wt%的Tween-20的pH为7~8的1× TE缓冲液，所述的荧光染料为SUPER Green Ⅱ。/n

【技术特征摘要】
1.一种单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：包括稀释缓冲液、标准品1、标准品2和荧光染料，所述的稀释缓冲液为含有0.001~0.003wt%的Tween-20的pH为7~8的1×TE缓冲液，所述的荧光染料为SUPERGreenⅡ。


2.根据权利要求1所述的单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：所述的稀释缓冲液为含有0.0015~0.0025wt%的Tween-20的pH为7.2~7.8的1×TE缓冲液。


3.根据权利要求1所述的单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：所述的标准品1为含有0.001~0.003wt%的Tween-20的pH为7~8的1×TE缓冲液。


4.根据权利要求3所述的单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：所述的标准品1为含有0.0015~0.0025wt%的Tween-20的pH为7.2~7.8的1×TE缓冲液。


5.根据权利要求1所述的单链DNA定量检测试剂盒，其特征在于：所述的标准品2包括20ng/μL的碱基数为15~20个的单链寡核苷酸。


6.根据权利要求5所述的单链DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩洪金，陈旭，陈刚，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32